The subject of this work was the characterization of the two transporter proteins UmHxt1 and UmSrt1 from the biotrophic maize pathogen Ustilago maydis. Previous analyses showed that deletion mutants for the genes hxt1 and srt1 displayed a drastically reduced pathogenicity after infection of maize plants. Studies on the expression additionally revealed that hxt1 is constitutively expressed, whereas srt1 is specifically induced upon infection. This implicates an important role of Srt1 during the infection process. Transport characteristics of Hxt1 and Srt1 were identified by heterologous expression of their genes in baker’s yeast and uptake experiments with radiolabelled substrates. Protein fusions with fluorophores were targeted to the plasma membrane of the yeast cells enabling such experiments. Hxt1 is a high-affinity monosaccharide transporter with a Km of 18 µM for glucose. Srt1 is a high-affinity and very specific sucrose transporter with a Km of 26 µM for sucrose. It is to date the first characterized sucrose transporter from a pathogenic fungus. Phylogenetic analyses showed in addition that Srt1 is a novel transport protein being more closely related to plant and fungal monosaccharide transporters than to the plant sucrose transporters. Consistently, Srt1 displays a monosaccharide transporter-like transport mechanism, allowing efflux of the substrate at high cytoplasmic concentrations of sucrose. The role of Srt1 during infection was explored by complementation of the Ustilago maydis mutant ?srt1 with plant sucrose transporters. AtSUC9 was able to restore pathogenicity in ?srt1, implicating that sucrose transport alone is enough and essential for the pathogenicity of Ustilago maydis and consequently the function of Srt1. Vice versa, the complementation of an Arabidopsis thaliana mutant was used to reveal the transport characteristics that are necessary to substitute the function of AtSUC2 in phloem loading. Srt1 and AtSUC1 were used because Srt1 differs from AtSUC2 in Km value and transport mechanism, whereas AtSUC1 only shows a different pH-dependency compared to AtSUC2. The srt1 and AtSUC1 transcripts and the correct localisation of the proteins in planta were verified by RT-PCR and immunolocalization with specific Srt1 or AtSUC1 antibodies, respectively. Transport activity of Srt1 in Arabidopsis protoplasts was shown by uptake of radiolabelled sucrose. Both genes were expressed under the control of the companion cell-specific AtSUC2 promoter, but only AtSUC1 was able to rescue the developmental phenotype of the Atsuc2 mutant. Furthermore, the effect of redox-active substances on the Srt1 activity was investigated, as reducing substances show a reversible effect on the inhibitory effect of PCMBS, but Srt1-mediated transport is PCMBS-insensitive. All tested reducing and oxidizing agents only had a weak inhibitory effect on Srt1, StSUT1 from potato and ZmSUT1 from maize. During those analyses it was revealed, that Srt1 and ZmSUT1 activity have different pH-dependencies, possibly enabling a regulatory function at the Ustilago maydis/maize interaction zone. In a side project T-DNA insertion lines for the genes of the two polyol/monosaccharide transporters AtPMT3 and AtPMT6 from Arabidopsis were characterized and the subcellular localization of PMT6 in yeast cells was modified. Neither single nor double knock-out lines showed any phenotypical differences compared to the wild type. Different deletion and fusion experiments to target PMT6, which is located in internal structures in yeast cells, to the plasma membrane to enable uptake of radiolabelled substrates did not give any positive results.

Gegenstand dieser Arbeit war die Charakterisierung von zwei Transportproteinen, UmHxt1 und UmSrt1, aus dem biotrophen Maispathogen Ustilago maydis. Im Vorfeld durchgeführte Analysen hatten ergaben, dass Deletionsmutanten der beiden entsprechenden Gene hxt1 und srt1 nach Infektion von Maispflanzen einen ausgeprägten Pathogenitätsphänotyp zeigten, bei dem es zu drastisch reduzierten Infektionssymptomen kam. Des Weiteren ging aus Expressionsstudien hervor, dass hxt1 konstitutiv, srt1 hingegen spezifisch in der Infektionsphase exprimiert wird, was auf eine spezielle Rolle von Srt1 während der Infektion schließen ließ, welche ebenfalls untersucht wurde. Durch heterologe Expression der Gene in Bäckerhefe und anschließende Aufnahmemessungen mit radioaktiven Substraten wurden die Transporteigenschaften von Hxt1 und Srt1 bestimmt. Fluorophorfusionen beider Proteine wurden in der PM der Hefezellen lokalisiert, was diese Experimente ermöglichte. Hxt1 ist ein hochaffiner MST mit einem Km-Wert von 18 µM für Glc. Srt1 ist ein hochaffiner ungewöhnlich spezifischer Suc-Transporter mit einem Km-Wert von 26 µM für Suc. Er ist der erste bislang beschriebene Suc-Transporter aus Pilzen. Phylogenetische Analysen belegten zudem, dass Srt1 ein neuartiges Suc-Transportprotein darstellt, das näher verwandt zu pflanzlichen und pilzlichen MSTs als zu den pflanzlichen SUCs ist. Damit übereinstimmend weist Srt1 einen MST-ähnlichen Transportmechanismus auf, der bei hohen Innenkonzentrationen auch Export von Suc zulässt. Die Rolle von Srt1 während der Infektion wurde durch die Komplementation der Ustilago-Mutante ?srt1 durch pflanzliche SUCs erforscht. AtSUC9 war in der Lage, die Pathogenität von ?srt1 wiederherzustellen, was den Schluss zulässt, dass der Suc-Transport alleine ausreichend und essentiell für die Pathogenität von Ustilago und folglich auch die Funktion von Srt1 ist. Im Gegenzug wurde durch die Komplementation der Arabidopsis thaliana suc2-Mutante getestet, welche Transporteigenschaften nötig sind, um die Funktion von AtSUC2 bei der Phloembeladung zu ersetzen. Srt1 und AtSUC1 wurden hierfür verwendet, da Srt1 sich vor allem im Km-Wert und im Transportmechanismus, AtSUC1 sich hingegen in der pH-Abhängigkeit von AtSUC2 unterscheidet. Die Srt1- und AtSUC1-Transkripte bzw. -Proteine und deren korrekte Lokalisation in planta wurden durch RT-PCR bzw. Immunolokalisierung mit spezifischen Srt1- bzw. SUC1-Antikörpern nachgewiesen. Die Transportaktivität von Srt1 in Arabidopsis-Protoplasten wurde durch Aufnahme radioaktiver Suc gezeigt. Beide Gene wurden unter der Kontrolle des geleitzellspezifischen AtSUC2-Promotors exprimiert, jedoch konnte nur AtSUC1 den Entwicklungsphänotyp von Atsuc2 komplementieren. Weiterhin wurde der Einfluss von Redox-Agenzien auf die Aktivität von Srt1 untersucht, da reduzierende Substanzen reversibel auf den inhibitorischen Effekt des sulfhydrylgruppenmodifizierenden Agens’ PCMBS wirken, Srt1-vermittelter Suc-Transport jedoch PCMBS-unabhängig ist. Alle getesteten reduzierenden oder oxidierenden Substanzen hatten sowohl auf Srt1 als auch auf StSUT1 aus Kartoffel und auf ZmSUT1 aus Mais einen richtungsgleichen, und zwar nur schwach inhibitorischen Einfluss. Im Zuge dieser Analysen wurde jedoch deutlich, dass die Srt1- und ZmSUT1-Aktivität unterschiedliche pH-Abhängigkeiten aufweisen, die bei der Ustilago/Mais-Interaktion an der Interaktionszone regulatorische Funktion haben könnten. In einem Nebenprojekt wurden T-DNA-Insertionslinien bezüglich der beiden Gene der Polyol/Monosaccharid-Transporter AtPMT3 und AtPMT6 aus Arabidopsis charakterisiert und die subzelluläre Lokalisation von PMT6 in Hefen modifiziert. Sowohl Einzel- als auch Doppel-knockout-Pflanzen zeigten keine offensichtlichen Unterschiede zum Wt. Versuche, durch verschiedene Deletions- und Fusionsansätze den in Hefen in internen Strukturen lokalisierten PMT6 in die PM zu bringen, um dadurch das Protein mittels radioaktiver Aufnahmemessungen charakterisieren zu können, lieferten keine positiven Resultate.