Funktionalisierte Kohlenstoffnanoröhren als neuartiges Transfektionsmittel für effizientes gene silencing in Rattenkardiomyozyten

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2008-05-06
Issue Year
2008
Authors
Krajcik, Rastislav
Editor
Abstract

The lipophilic nature of biological membranes restricts the direct intracellular delivery of potential drugs and molecular probes and makes intracellular transport to one of the key problems in gene therapy. Because of their ability of crossing cell membranes, carbon nanotubes (CNTs) are of interest as carriers of biologically active molecules, such as small interfering RNAs (siRNAs). The aim of this work was to establish a simplified protocol for the functionalization of single walled CNTs to obtain a material which meets the following requirements: (1) non-covalent binding of unmodified, standard siRNAs, (2) efficient transport of siRNA into cells, (3) intracellular liberation of siRNA for efficient gene silencing, and (4) biocompatibility. Although CNTs are known to cross the cell membrane, the mechanisms of internalization are still unclear. In an attempt to address this question, uptake of CNTs into cells has been monitored by fluorescence and electron microscopy. While multi walled CNTs were well detectable by electron microscopy, it was not possible to demonstrate single walled CNTs within cells at the subcellular level so far. Thiolated single walled CNTs were tagged with gold nanoparticles, and thereby single walled CNTs were demonstrated inside of a cell by electron microscopy for the first time. CNTs were found in vesicular structures, directly supporting the hypothesis that CNTs are internalized by endocytosis. Moreover, a protocol for the direct attachment of the fluorescent dye FB-28 (calcofluor) to oxidized single walled CNTs was established. Notably, quenching of fluorescence is a well known problem when fluorophore are coupled directly to CNTs without spacers. A spacer, however, was not necessitated when using FB-28, thereby avoiding possible spacer-related changes in the intracellular distribution of CNTs. Using FB-28-labelled CNTs, their internalization into cells was demonstrated by confocal fluorescence microscopy. Thereafter, a protocol for the chemical functionalization of CNTs was established to obtain a biocompatible material which was able to bind negatively charged siRNA by electrostatic interactions. This was achieved by modification of single walled CNTs with hexamethylenediamine (HMDA) and further exohedral functionalization with cationic poly(diallyldimethylammonium)chloride (PDDA-HMDA-CNTs). Purity was confirmed by Raman spectroscopy and atomic force microscopy. This material exhibited negligible cytotoxic effects on isolated rat heart cells at concentrations up to 10 mg/l. siRNA complexed to PDDA-HMDA-CNTs translocated into otherwise hard-to-transfect primary rat cardiomyocytes. Confocal microscopy of fluorescently labelled siRNA revealed that siRNA bound to PDDA-HMDA-CNTs was able to cross the cell membrane efficiently and to accumulate within the cell. Inside the cells, the siRNA was released and successfully induced degradation of the target-mRNA. Two different siRNAs against extracellular signal-regulated kinases (ERK1 and ERK2) were tested, which markedly suppressed expression of their target proteins in primary cardiomyocytes by 77% and 74%, respectively. PDDA-functionalized CNTs thus present an effective carrier system for applications in siRNA mediated gene silencing. The presentation of a simplified and cost-effective protocol for carbon nanotube (CNT) functionalization, which allows non-covalent binding of commercially available unmodified standard siRNA for gene silencing, constitutes a further step toward possible in vivo applications of CNTs.

Abstract

Aufgrund des lipophilen Aufbaus biologischer Membranen wird der direkte Durchtritt von potentiellen Wirkstoffen und Markermolekülen verhindert. Dadurch ist der intrazelluläre Transport von Stoffen ein Schlüsselproblem in der Gentherapie. Aufgrund ihrer Eigenschaft, Zellmembranen zu durchqueren, sind Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) von Interesse als Träger für biologisch aktive Substanzen, wie z. B. so genannte small interfering RNAs (siRNAs). Ziel dieser Arbeit war es, eine einfach zu handhabende Vorschrift für die Funktionalisierung von CNTs zu entwickeln, die zu einer Verbindung mit folgenden Voraussetzungen führt: sie muss (1) unmodifizierte Standard-siRNA nicht-kovalent binden, (2) die siRNA effizient in Zellen transportieren, (3) die siRNA innerhalb der Zelle abkoppeln, damit effektives Gene Silencing erreicht wird und (4) darf nicht toxisch sein. Obwohl CNTs bekanntermaßen Zellmembranen passieren können, ist der Mechanismus der Aufnahme in die Zellen weiterhin nicht vollständig geklärt. Um zur Klärung dieser Frage beizutragen, wurden Aufnahmeversuche von CNTs in Zellen durchgeführt und fluoreszenz- und elektronenmikroskopisch analysiert. Obwohl mehrwandige CNTs per Elektronenmikroskopie gut nachweisbar sind, konnten bislang keine einwandigen CNTs innerhalb von Zellen in hoher Auflösung detektiert werden. Aus diesem Grund wurden CNTs mit Thiolfunktionen modifiziert, an die dann Goldnanopartikel gebunden wurden. Mit derart funktionalisierten CNTs konnten zum ersten Mal einwandige CNTs elektronenmikroskopisch innerhalb von Zellen dargestellt werden. Die CNTs befanden sich im Inneren zellulärer Vesikelstrukturen, was direkt die Hypothese der Endozytose als Aufnahmemechanismus für CNTs in Zellen stützt. Überdies wurde ein Protokoll entwickelt, um den Fluoreszenzfarbstoff FB 28 (Calcofluor) direkt an oxidierte CNTs zu binden. Ein bekanntes Problem bei der direkten Bindung von Fluorophoren ohne Spacer an CNTs ist die Fluoreszenzquenchung. Mit FB 28 trat jedoch keine Quenchung der Fluoreszenz auf, wodurch mögliche Verfälschungen bei der Detektion der intrazellulären Verteilung von CNTs vermieden wurden, die durch Spacer verursacht sein könnten. Mit Hilfe von FB 28 CNTs wurde die Internalisierung von CNTs in Zellen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Nachfolgend wurde ein Protokoll entwickelt, um CNTs derart chemisch zu funktionalisieren, damit ein biologisch verträgliches Material entsteht, das über elektrostatische Anziehung negativ geladene siRNA binden kann. Dies wurde erreicht durch Funktionalisierung von einwandigen CNTs mit Hexamethylendiamin (HMDA) und weitere exohedrale Modifikation mit dem Polykation Poly(Diallyldimethylammoniumchlorid) (PDDA-HMDA-CNTs). Die Reinheit dieser Verbindung wurde mittels Ramanspektroskopie und Atomic Force Microscopy überprüft. PDDA-HMDA-CNTs verursachten in Konzentrationen bis 10 mg/l lediglich vernachlässigbare zytotoxische Effekte in isolierten Rattenherzzellen. Diese funktionalisierten CNTs konnten siRNA komplexieren und in ansonsten schwer transfizierbare primäre Rattenkardiomyozyten transportieren. Konfokale Mikroskopie mit fluoreszenzmarkierter siRNA zeigte, dass an PDDA-HMDA-CNTs gebundene siRNA die Zellmembran passiert und sich im Inneren der Zellen akkumuliert. Innerhalb der Zellen wurde die siRNA von den CNTs freigegeben und induzierte erfolgreich die Degradation der Ziel-mRNA. Es wurden zwei unterschiedliche siRNAs gegen ERK1 bzw. ERK2 (extracellular signal-regulated kinase 1 bzw. 2) getestet. Beide siRNAs reduzierten signifikant die Expression des jeweiligen Zielproteins in primären Rattenkardiomyozyten um 77% (ERK1) bzw. 74% (ERK2). Somit stellen die PDDA-funktionalisierten HMDA-CNTs ein effektives Trägersystem für den Einsatz im siRNA-induzierten Gene Silencing dar. Die Entwicklung einer einfach zu handhabenden Vorschrift zur Funktionalisierung von Kohlenstoffnanoröhren (CNTs), um mit ihnen für erfolgreiches Gene Silencing kommerziell erhältliche, unmodifizierte Standard-siRNA nicht-kovalent zu verwenden, bedeutet einen weiteren Schritt in Richtung möglicher Anwendungen von CNTs in vivo.

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