Psychopharmaka und Antibiotika beeinflussen die genomische DNA-Methylierung von SH-SY5Y Neuroblastomzellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-11-19
Issue Year
2009
Authors
Meintker, Lisa Marie
Editor
Abstract

Epigenetic mechanisms like DNA methylation are important for many physiological processes especially for regulation of gene transcription and stabilization of chromatin structure. Even though changes in the methylation pattern are known in many psychiatric diseases the epigenetic influence of medications especially psychotropic drugs has hardly been tested. Therefore the aim of this study was to examine the effects of mood stabilizers (carbamazepine, lithium, valproate), neuroleptics (haloperidol, olanzapin, quetiapine, risperidone), antidepressants (amitriptyline, fluoxetine, tranylcypromine) as well as the two antibiotics cefotiam and ciprofloxacin on genomic DNA methylation in cell culture. 5-Aza-2’-deoxycytidine, methotrexate and S-Adenosyl-L-methionine served as reference substances. Methods: In cell culture SH-SY5Y neuroblastoma cells were stimulated with the substances mentioned above for varying durations of 6 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days and 5 days to quantify alterations in genomic methylation. The appropriate substance concentrations for stimulation were determined using a MTT cell viability assay. Genomic DNA methylation was measured by a modified, fluorescent Cytosin elongation assay based on a DNA restriction digestion and subsequent fluorescence labelling using an elongation reaction. Results: Treatment with the reference substance 5-Aza-2’-deoxycitidine showed a significant, nearly complete demethylation after two days (p = 0,024) and likewise stimulation with methotrexate lead to a significant decline of methylation (p = 0,005) within the same time. Stimulation with S-Adenosyl-L-methionine had no significant effect on genomic DNA methylation in the performed tests (p = 0,140). The investigated mood stabilizers lithium (p = 0,007) and valproate (p = 0,030) caused a significant hypomethylation. When using valproate hypomethylation set in within the first hours, whereas when using lithium a comparable decrease of methylation began after 12 hours. Cells treated with carbamazepine did not show a tendency towards hypometylation until the fifth day which was not significant (p = 0,084). Among the neuroleptics merely risperidone had a significant influence in terms of a reduced DNA methylation within the first two days (p = 0,006). Two more examined atypical neurolepics olanzapine (p = 0,246) and quetiapine (p = 0,159) indicated a tendency towards demethylation although to no significant level. Haloperidol as a conventional neuroleptic had no significant impact on genomic methylation during the whole experiment (p = 0,437). Among the tested antidepressants the tricyclic antidepressant amitriptyline (p < 0,001) as well as the SSRI fluoxetine (p < 0,001) showed highly significant hypomethylating properties; the MAO inhibitor tranylcypromine however did not significantly affect the degree of DNA methylation (p = 0,183). The antibiotics cefotiam (p = 0,021) and ciprofloxacin (p = 0,193) lead to DNA hypermethylation, though only cefotiam showed significant effects. These findings indicate that several psychotropic drugs especially mood stabilizers, antidepressants and to a lesser extent neuroleptics bring about epigenetic changes in the form of lowered DNA methylation. With regard to potential pathological methylation patterns in the development of psychiatric diseases this could disclose new therapeutic approaches and therefore should be further investigated. Additional gene specific analyses regarding the impact of psychotropic drugs on DNA methylation e.g. dopamine transporter and serotonergic genes are necessary to detect possible pathophysiological correlations.

Abstract

Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung spielen bei zahlreichen physiologischen Prozessen, insbesondere bei der Regulation von Genexpression und Stabilisierung der Chromatinstruktur, eine wichtige Rolle. Obwohl Veränderungen in den Methylierungsmustern bei einer Vielzahl psychiatrischer Erkrankungen bekannt sind, ist der epigenetische Einfluss von Medikamenten speziell von Psychopharmaka bis heute kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit war es deshalb den Einfluss von Mood-Stabilizern (Carbamazepin, Lithium, Valproinsäure), Neuroleptika (Haloperidol, Olanzapin, Quetiapin, Risperidon), Antidepressiva (Amitriptylin, Fluoxetin, Tranylcypromin) und den beiden Antibiotika Cefotiam und Ciprofloxacin auf die genomische DNA-Methylierung in Zellkultur zu prüfen. Als Referenzsubstanzen dienten 5-Aza-2’-deoxycytidin, Methotrexat und S-Adenosyl-L-methionin. Methoden: In Zellkulturexperimenten wurden SH-SY5Y Neuroblastomzellen mit den oben genannten Substanzen über 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage und 5 Tage stimuliert, um Methylierungsveränderungen im zeitlichen Verlauf zu erfassen. Geeignete Stimulations-konzentrationen der einzelnen Substanzen wurden mit Hilfe eines MTT-Zellvitalitätstests bestimmt. Die Messung der genomischen Methylierung erfolgte mit einem modifizierten, fluoreszenzmarkierten Cytosin-Elongationsassay, beruhend auf einem DNA-Restriktionsverdau und einer anschließenden Fluoreszenzmarkierung mittels einer Elongationsreaktion. Ergebnisse: Bei den Referenzsubstanzen zeigte sich nach Behandlung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin eine signifikante, nahezu vollständige Demethylierung nach zwei Tagen (p = 0,024) und auch bei Stimulation mit Methotrexat kam es innerhalb dieser Zeit zu einem signifikanten Abfall der Methylierung (p = 0,005). Hingegen hatte die Stimulation mit S-Adenosyl-L-methionin in den durchgeführten Versuchen keinen signifikanten Effekt auf die genomische DNA-Methylierung (p = 0,140). Die untersuchten Mood-Stabilizer Lithium (p = 0,007) und Valproinsäure (p = 0,030) bewirkten eine signifikante Hypomethylierung, wobei unter Valproinsäure diese Reaktion bereits innerhalb der ersten Stunden zu beobachten war, während bei Lithium ein vergleichbarer Abfall der Methylierung nach 12 Stunden einsetzte. Die mit Carbamazepin behandelten Zellen zeigten erst nach fünf Tagen eine Tendenz zur Hypomethylierung, die aber nicht signifikant war (p = 0,084). Bei den Neuroleptika hatte lediglich Risperidon einen signifikanten Einfluss im Sinne einer verminderten DNA-Methylierung innerhalb der ersten zwei Tage (p = 0,006). Zwei weitere getestete, atypische Neuroleptika Olanzapin (p = 0,246) und Quetiapin (p = 0,159) wiesen ebenfalls die Tendenz zur Demethylierung auf, wenngleich dies keine Signifikanz erreichte. Haloperidol als typisches Neuroleptikum veränderte während des gesamten Versuchsverlaufs die genomische Methylierung nicht signifikant (p = 0,437). Von den untersuchten Antidepressiva hatten sowohl das Trizyklikum Amitriptylin (p < 0,001) als auch das SSRI Fluoxetin (p < 0,001) eine hoch signifikante, hypomethylierende Wirkung; der MAO-Inhibitor Tranylcypromin beeinflusste den Grad der DNA-Methylierung nicht signifikant (p = 0,183). Die Antibiotika Cefotiam (p = 0,021) und Ciprofloxacin (p = 0,193) führten zu einer DNA-Hypermethylierung, die allerdings nur bei Cefotiam ein signifikantes Niveau erreichte. Die Ergebnisse belegen, dass einige Psychopharmaka insbesondere Mood-Stabilizer, Antidepressiva und in geringerem Ausmaß auch Neuroleptika epigenetische Veränderungen in Form einer verringerten DNA-Methylierung bewirken können. Im Hinblick auf mögliche pathologische Methylierungsmuster bei der Entstehung psychiatrischer Erkrankungen eröffnet dies neue Therapieansätze und sollte daher weiter untersucht werden. Außerdem sind zusätzliche genspezifische Analysen zum Einfluss von Psychopharmaka auf die DNA-Methylierung (z.B. Dopamintransporter, serotonerge Gene) notwendig, um möglicherweise pathophysiologische Zusammenhänge zu detektieren.

DOI
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