Immunhistochemsiche Analyse zum Vergleich der Auswirkungen von Aminobisphosphonaten auf die Expression von Sclerostin, Galectin-3 und IRF5 im Kieferknochen und der Tibia der Wistar-Ratte

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Granting Institution
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Medizinische Fakultät
Issue Date
2024-01-31
Authors
Schönau, Johanna
Editor
Abstract

Hintergrung Aufgrund ihrer erfolgreichen therapeutischen Wirkung unter anderem bei Osteoporose-bedingten Frakturen wurden Antiresorptiva, zu denen auch die Gruppe der Bisphosphonate (BPs) gehört, zu den am häufigsten verschriebenen Medikamenten im frühen 21. Jahrhundert. Nachdem seit 2003 eine steigende Zahl an Fallberichten über unerwünschte Nebenwirkungen wie die Kieferknochennekrose veröffentlicht wurde, ist der Einsatz der Substanz zurückhaltender geworden. Die genaue Pathogenese der Medikamenten-assoziierten Kieferknochennekrose (MRONJ) und der Grund für die Beschränkung dieser Krankheit auf den Kieferknochen ist bis heute unklar. Einer der Schlüsselfiguren sowohl in der Knochenentwicklung als auch in der Aufrechterhaltung der Gewebe-Homöostase ist der Wnt/β-Catenin Signalweg. Es hat sich herausgestellt, dass dieser eine wichtige Rolle im Knochenaufbau spielt, indem er Osteoblasten und Osteoklasten koordiniert. Reguliert wird der Signalweg unter anderem durch das endogene Inhibitor-Protein Sclerostin, das haupt-sächlich von Osteozyten exprimiert wird. Sclerostin hat nicht nur einen stark inhibitorischen Effekt auf den Wnt-Signalweg, sondern ist außerdem jüngster Angriffspunkt der pharmakologischen Osteoporose-Therapie geworden. Ebenfalls assoziiert mit dem Wnt-Signalweg ist das multifunktionale Protein Galectin-3. Es fungiert als wichtiges Regulator-Protein im Knochenstoffwechsel, indem es die Differenzierung von Osteoblasten und Osteo-klasten koordiniert. Zusätzlich zu Sclerostin und Galectin-3 soll der Makrophagen-Marker IRF5 analysiert werden, der ebenfalls eine kritische Rolle im Knochenumbau einnimmt. In dieser Arbeit soll die Pathogenese der MRONJ, unter Annahme einer veränderten Knochen-Remodeling Rate in MRONJ-affektiertem Gewebe, weiter untersucht werden.

Methoden In Summe wurden 64 männliche Wistar-Ratten in das Experiment eingeschlossen. Diese wurden in eine Kontrollgruppe (Gruppe eins, 32 Tiere) und eine BP-Gruppe (Gruppe zwei, 32 Tiere) unterteilt. Die Tiere der Gruppe eins erhielten keine Therapie. Die Tiere der Gruppe zwei erfuhren eine wöchentliche Aminobisphosphonat-Therapie (Zoledronat, Zometa, Novartis Pharma, intravenös, 40 µg/kg KG) über einen Zeitraum von 8 Wochen. In beiden Gruppen wurden nach 8, 10, 12 und 16 Wochen jeweils 8 Tiere geopfert. Aus den Kiefer-knochen und Tibien der Tiere wurden Gewebeproben entnommen und zu zwei µm dicken Schnitten verarbeitet, um eine immunhistochemische Färbung zu ermöglichen. Es erfolgte eine immunhistochemische Färbung der Antigene Galectin-3, Sclerostin und IRF5, außerdem eine Übersichtsfärbung mit Trichrom-Masson-Goldner. Nach der Digitalisierung der Schnitte wurden die Sclerostin-positiven Zellen und die Osteozyten mit Hilfe der Software „Biomas“ ausgezählt. Die Ergebnisse wurden mittels SPSS statistisch ausgewertet und schließlich in Box Plots und Tabellen veranschaulicht.

Ergebnisse Die Übersichtsfärbung mit Trichrom-Masson Goldner erlaubte eine deskriptive Analyse des Gewebes. Histomorphologische Aspekte einer Nekrose konnten im Kieferknochen beschrieben werden, waren aber unspezifisch und unterschiedlich stark ausgeprägt. Im Kieferknochen wurde die Osteozyten-Dichte in der BP-Gruppe signifikant niedriger ausge-zählt als in der Kontrollgruppe. In der Tibia unterschied sich die Osteozyten-Dichte nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen. Die Immunhistochemische Färbung mit Anti-Sclerostin zeigte deutlich erkennbar braun gefärbte Zellen. Die Sclerostin-Expression unter-schied sich zwischen den Knochen: Im Kieferknochen zeigte die BP-Gruppe eine höhere Sclerostin-Expression als die Kontrollgruppe. In der Tibia war die Sclerostin-Expression in der BP-Gruppe sogar signifikant höher verglichen mit der Kontrollgruppe. Ein Trend der Sclerostin-Expression beim Vergleich der unterschiedlichen Entnahme-Zeitpunkte konnte nicht in allen Gruppen festgestellt werden. Die Expression des Proteins im Kiefer der BP-Gruppe stieg mit Dauer der Therapie stetig an. Die Proteine Galectin-3 und IRF5 ließen sich im Rattenknochen nicht nachweisen, obwohl das Färbeprotokoll mehrfach umgestellt wurde.

Schlussfolgerungen Die Applikation von BPs beeinflusst die Expression von Sclerostin sowohl im Kieferknochen als auch in der Tibia. Obwohl die Osteozyten-Dichte in BP-ausgesetztem Kieferknochen im Vergleich zur Kontrollgruppe abfällt, zeigte sich die Sclerostin-Expression höher. Da Sclerostin ein Inhibitor-Protein des kanonischen Wnt-Signalwegs ist, der eine Schlüsselfigur in der Regulation des Knochen-Remodelings darstellt, kann vermutet werden, dass das Protein zur Pathogenese der BRONJ beiträgt. Es muss weiter untersucht werden, ob ein BP-induzierter Anstieg der Sclerostin-Expression zu einer Dysregulation der Knochen-Homöostase führt, oder ob umgekehrt nekrotisierendes Knochengewebe die Sclerostin-Expression beeinflusst, beispielsweise aufgrund veränderten mechanischen Druck-verhältnissen. Da die Knochenstoffwechsel-Mediatoren Galectin-3 und IRF5 nicht immun-histochemisch nachgewiesen werden konnten, wird hypothetisiert, dass sowohl Galectin-3 als auch IRF5 im Kieferknochen und der Tibia der Wistar-Ratte nicht großflächig exprimiert werden. Da beide aber eine wichtige Rolle in Prozessen des Knochen-Remodelings spielen, muss ihre Beteiligung an der Pathogenese der BRONJ weiter erforscht werden.

DOI
URN
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