Wirkung der ionisierenden Strahlung auf verschiedene Subtypen der Makrophagen mit hTNF-α tg und C57Bl / 6-Mäusen als Modellsystem

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Granting Institution
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Medizinische Fakultät
Issue Date
2024
Authors
Titova, Eva
Editor
Abstract

Hintergrund und Ziele: Basierend auf dem aktuellen Stand der Wissenschaft ist bekannt, dass verschiedene Zelltypen auf niedrig dosierte Röntgenstrahlung mit einer antientzündlichen Reaktion reagieren. Die genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig erforscht. Rheumatische Arthritis (RA) ist eine entzündliche Erkrankung, bei der Makrophagen eine bedeutende Rolle spielen. Daher ist die Wirkung von Röntgenstrahlen auf Makrophagen von großem wissenschaftlichem und klinischem Interesse. Das Ziel dieser Arbeit ist es, das Verständnis für den Zusammenhang zwischen der Reaktion von Makrophagensubtypen (M0, M1, M2) auf verschiedene Intensitäten von Röntgenstrahlung zu vertiefen. Da bereits gezeigt wurde, dass der Entzündungsstatus der Zellen eine Rolle bei der Reaktion auf niedrig dosierte Röntgenstrahlung spielt und das Geschlecht möglicherweise ebenfalls eine Rolle bei der Strahlensensitivität spielt, werden entsprechende Experimente durchgeführt. Insbesondere wird die Reaktion von Wildtyp-Makrophagen (wt) und Makrophagen aus TNFα-transgenen (hTNFα tg) Mäusen, die ein Modellsystem für RA sind, auf die Bestrahlung untersucht. Veränderungen nach der Bestrahlung werden durch die Analyse von Oberflächenmarkern und funktionellen Aspekten wie der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Stickstoffmonoxid und der Aktivität des entzündungshemmenden Enzyms Arginase erfasst. Methoden: Um die gestellten Forschungsfragen zu beantworten, wurden Makrophagen aus dem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen und genetisch modifizierten hTNFα tg-Mäusen isoliert. Die Differenzierung erfolgte mittels Wachstumsfaktoren wie MCSF, GMCSF und Zytokinen wie IL4, INFg sowie LPS zu den Subtypen M0, M1 und M2. Alle Experimente wurden in vitro durchgeführt. Nach Bestrahlung mit verschiedenen Intensitäten von Röntgenstrahlung (0, 0.1, 0.5, 1 und 2 Gy) erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der Expression von Oberflächenmarkern (CD80, CD86, MHCII, CD206) auf den Makrophagensubtypen. Um eine mögliche Aktivierung oder Hemmung der Entzündungsreaktion nach Bestrahlung nachzuweisen, wurden zudem funktionelle Prozesse wie ROS- und NO-Konzentrationen, gemessen. Zudem werden die immuninhibitorischen Liganden PD-L1 und PD-L2 auf der Zelloberfläche untersucht, da Hinweise darauf bestehen, dass auch niedrig dosierte Röntgenstrahlung ihre Expression beeinflussen kann. Ergebnisse und Beobachtungen: Bei niedriger Strahlendosis wird eine Verringerung der Entzündungsmarker (CD 80, CD 86) auf der Zelloberfläche beobachtet, während eine Dosis von 2,0 Gy die Expression erhöhte, was auf unterschiedliche Zellreaktion auf verschiedenen Strahlendosen hindeutet. Die Bestrahlung beeinflusste auch die Makrophagenfunktionalität, insbesondere bei niedrigen Dosen, indem die Expression von Immuncheckpoints (PD-L1,2) erhöht wird, was eine immunsuppressive Wirkung hat. Zudem hemmt eine niedrige Bestrahlungsdosis effektiv die ROS-Produktion und steigert leicht die Arginase-Aktivität, während die NO-Konzentration kaum beeinflusst wird. Die Effekte sind jedoch stark vom Makrophagenphänotyp abhängig. Der Bereich von 0,1 bis 1,0 Gy deutet darauf hin, dass Röntgenstrahlung entzündungshemmende Eigenschaften im dem Bereich haben könnte. Interessanterweise zeigen die Ergebnisse auch, dass männliche Makrophagen aus hTNFα tg Mäusen eine erhöhte Expression entzündungshemmender Marker und eine verstärkte Arginase-Aktivität aufweisen, was darauf hinweist, dass männliche Sexualhormone eine antientzündliche Wirkung haben könnten und möglicherweise erklären, warum Männer seltener an bestimmten Krankheiten leiden. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse der Experimente legen nahe, dass Röntgenstrahlung eine Wirkung auf Makrophagen und ihre Rolle bei Entzündungsprozessen hat. Zukünftige Experimente könnten die Effekte von Mehrfachbestrahlungen und schonender fraktionierter Bestrahlung vertiefen. Interessant wäre auch die Untersuchung des Einflusses von Röntgenstrahlung auf die Sekretion von verschiedenen Zytokinen sowie die entzündungshemmende Wirkung von männlichen Hormonen. Es ist jedoch zu beachten, dass die in vitro Experimente Limitationen aufweisen, da komplexe in vivo Aspekte fehlen. Zukünftige in vivo Untersuchungen sollten die Wechselwirkungen mit dem umgebenden Gewebe und dem Immunsystem berücksichtigen. Die optimale Dosierung zeigt eine Abhängigkeit vom Zellgenotyp, Subtyp und Hormonstatus. Es wäre daher sinnvoll, weitere Experimente durchzuführen, um die ideale Dosierung zu ermitteln und somit die besten Therapieoptionen für Frauen, Männer und Patienten mit entzündlichem Grundstatus wie erhöhter Konzentration von TNF-Alpha zu identifizieren. Es könnte sich herausstellen, dass unterschiedliche Patientengruppen verschiedene Bestrahlungsdosen benötigen, um optimale Wirkung zu erzielen.

Abstract

Objectives: Based on the current state of science, it is known that various cell types respond to low-dose X-ray radiation with an anti-inflammatory reaction. However, the exact mechanisms are not yet fully understood. Rheumatoid arthritis (RA) is an inflammatory disease in which macrophages play a significant role. Therefore, the effect of X-rays on macrophages is of great scientific and clinical interest. The aim of this study is to deepen understanding of the relationship between the reaction of macrophage subtypes (M0, M1, M2) to different intensities of X-ray radiation. Since it has already been shown that the inflammatory status of cells plays a role in the response to low-dose X-ray radiation and gender may also play a role in radiation sensitivity, corresponding experiments are being conducted. Specifically, the response of wild-type macrophages (wt) and macrophages from TNFα-transgenic (hTNFα tg) mice, which serve as a model system for RA, to irradiation is examined. Changes after irradiation are assessed through the analysis of surface markers and functional aspects such as the production of reactive oxygen species, nitric oxide, and the activity of the anti-inflammatory enzyme arginase. Methods: To address the research questions posed, macrophages were isolated from the bone marrow of wild-type mice and genetically modified hTNFα tg mice. Differentiation was induced using growth factors such as MCSF, GMCSF, and cytokines such as IL4, INFg, as well as LPS to generate M0, M1, and M2 subtypes. All experiments were conducted in vitro. Following irradiation with various intensities of X-ray radiation (0, 0.1, 0.5, 1, and 2 Gy), flow cytometric analysis of surface marker expression (CD80, CD86, MHCII, CD206) on macrophage subtypes was performed. Additionally, functional processes such as ROS and NO concentrations were measured to detect potential activation or inhibition of the inflammatory reaction post-irradiation. Furthermore, immunoinhibitory ligands PD-L1 and PD-L2 on the cell surface are investigated as there is evidence that even low-dose X-ray radiation can influence their expression. Results and Observations: At low radiation doses, a reduction in inflammation markers (CD80, CD86) on the cell surface is observed, while a dose of 2.0 Gy increased expression, indicating differential cell responses to different radiation doses. Irradiation also influenced macrophage functionality, particularly at low doses, by increasing the expression of immune checkpoints (PD-L1,2), which have an immunosuppressive effect. Additionally, a low radiation dose effectively inhibits ROS production and slightly enhances arginase activity, while NO concentration is barely affected. However, the effects strongly depend on macrophage phenotype. The range from 0.1 to 1.0 Gy suggests that X-ray radiation could have anti-inflammatory properties in this range. Interestingly, the results also show that male macrophages from hTNFα tg mice exhibit increased expression of anti-inflammatory markers and enhanced arginase activity, suggesting that male sex hormones could have an anti-inflammatory effect and may explain why men are less prone to certain diseases. Conclusions: The results of the experiments suggest that X-ray radiation has an effect on macrophages and their role in inflammatory processes. Future experiments could further explore the effects of multiple irradiations and gentler fractionated irradiation. It would also be interesting to investigate the influence of X-ray radiation on the secretion of various cytokines as well as the anti-inflammatory effect of male hormones. However, it should be noted that in vitro experiments have limitations as complex in vivo aspects are lacking. Future in vivo studies should consider interactions with surrounding tissue and the immune system. The optimal dosage appears to depend on cell genotype, subtype, and hormonal status. Therefore, further experiments to determine the ideal dosage and thus identify the best therapeutic options for women, men, and patients with an inflammatory background such as elevated TNF-alpha concentration would be advisable. It may turn out that different patient groups require different radiation doses to achieve optimal efficacy.

DOI
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