Klasse III POU-Transkriptionsfaktoren als wichtige Regulatoren der frühen Gehirnentwicklung

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-05-12
Issue Year
2009
Authors
Wolf, Michael
Editor
Abstract

Members of the class III POU transcription factor family display highly similar expression patterns and biochemical properties. The POU proteins Oct-6 and Brn-1 show complete functional equivalence during Schwann cell development, as demonstrated by the generation of Oct-6brn-1/brn1-mice (Friedrich, et al., 2005). Surprisingly these mutants display severe malformations of the brain with high but incomplete penetrance. The aim of this study was to determine the affected brain regions as well as to elucidate the underlying mechanism. By in situ hybridisation with markers such as Pax6, Emx1 and Six3, the forebrain was identified as the most affected region. Markers such as Mash1 and Hoxb1 showed no significant alteration, pointing to fairly normal development of mid- and hindbrain. This conclusion was confirmed by the examination of the important signal molecules Shh and Fgf8 which exhibited an unchanged expression pattern in the posterior brain of homozygous mice. In the anterior parts, however, Shh and Fgf8 expression were significantly altered. Analysis of the cranial neural crest did not implicate this cell type in the phenotype. Additional important insights were obtained by the analysis of Wnt1 expression, which is known to play a crucial role in the development of the forebrain. Strikingly, Wnt1 expression in the Oct-6brn-1/brn1-mice was expanded rostrally, in a manner comparable to other mouse mutants with forebrain defects. This strongly indicates that Oct-6 and Brn-1 may have a regulatory influence on Wnt1 expression, which in turn may account for the phenotype. In fact, chromatin immunprecipitations confirmed binding of POU proteins to regulatory sequences of the Wnt1 gene in vivo. Reporter gene assays furthermore revealed that both POU proteins repress Wnt1 expression. However, Brn-1 turned out to be a weaker repressor than Oct-6 resulting in weaker Wnt-1 repression in the Oct-6brn-1/brn1 mutant mice. This probably causes the rostral expansion of the Wnt-1 expression in Oct-6brn-1/brn1-mice and the corresponding forebrain defect, thereby providing new insights into the function of class III POU transcription factors as regulators of early brain development.

Abstract

Die Mitglieder der Klasse III POU-Transkriptionsfaktorfamilie weisen eine große Ähnlichkeit in ihrem Expressionsmuster und ihren biochemischen Eigenschaften auf. Eine vollständige funktionelle Äquivalenz konnte für die POU-Proteine Oct-6 und Brn-1 in vivo während der Schwann-Zell-Entwicklung durch die Generierung von Oct-6brn-1/brn1-Mäusen bewiesen werden (Friedrich, et al., 2005). Umso überraschender war die Beobachtung, dass diese Tiere mit hoher aber nicht vollständiger Penetranz schwere Fehlentwicklungen des Gehirns aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zum einen die von den Fehlbildungen betroffenen Gehirnregionen bestimmt werden und zum anderem der dem Phänotyp zugrunde liegende Mechanismus geklärt werden. Durch in-situ-Hybridisierungen mit spezifischen Markern wie Pax6, Emx1 und Six3 konnte das Vorderhirn als am stärksten betroffene Region identifiziert werden, während die Analyse mit Markern wie Mash1 und Hoxb1 eine weitgehend normale Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns nachwies. Dies wurde bestätigt durch die Untersuchung der wichtigen Signalmoleküle Shh und Fgf8, deren Expressionsmuster im posterioren Gehirn homozygoter Mäuse unverändert war, in anterioren Bereichen betroffener Tiere aber deutliche Veränderungen aufwies. Die Analyse der kranialen Neuralleiste lieferte keinerlei Hinweise auf eine ursächliche Beteiligung dieses Zelltyps am vorliegenden Phänotyp. Eine wichtige Erkenntnis lieferte die Analyse von Wnt1, das einerseits einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung des Vorderhirns ausübt und andererseits in seiner Expression im Gehirn von Oct-6brn-1/brn1-Mäusen rostral expandiert war. Letzteres wurde auch bei anderen Mausmutanten mit Vorderhirn-Defekten beobachtet, weshalb ein regulatorischer Einfluß von Oct-6 bzw. Brn-1 auf die Wnt1-Expression als phänotypische Ursache denkbar erschien. In der Tat konnte durch Chromatin-Immunpräzipitation eine Bindung der POU-Proteine an regulatorische Sequenzen des Wnt1-Gens in vivo nachgewiesen werden. Darüber hinaus ergaben Reportergen-Analysen, dass beide POU-Proteine die Wnt1-Expression reprimieren, wobei Oct-6 einen stärkeren Repressor darstellte als Brn-1. Die im Vergleich zum Wildtyp schwächere Reprimierung ist wahrscheinlich der Hauptgrund für die rostrale Expansion der Wnt1-Expression und dem daraus resultierenden Vorderhirndefekt der Oct-6brn-1/brn1-Mäuse. Sie liefert neue Einblicke in die Funktion von Klasse III POU-Transkriptionsfaktoren als Regulatoren der frühen Gehirnentwicklung.

DOI
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