Heterologe Expression und Charakterisierung der Ionenkanalfunktion von humanem Polycystin-2 im Oozytenexpressionssystem

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Granting Institution
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Medizinische Fakultät
Issue Date
2024
Authors
Staudner, Tobias
Editor
Abstract

Hintergrund und Ziele der Arbeit Mutationen in dem für Polycystin-2 kodierenden Gen PKD2 sind für etwa 15% aller Fälle der autosomal-dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) verantwortlich (Ong and Harris, 2015). Obwohl Polycystin-2 zur Familie der transient-receptor-potential (TRP) Ionenkanäle gehört (Wu et al., 2010), sind die bisherigen Befunde zu den Ionenkanaleigenschaften von Polycystin-2 uneinheitlich und zum Teil kontrovers. Insbesondere konnte die Ionenselektivität von Polycystin-2 für mono- und divalente Kationen noch nicht eindeutig geklärt werden (Cantero and Cantiello, 2022, Shen et al., 2016). Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung, Charakterisierung und Validierung eines Polycystin-2-Konstrukts mit erhöhter Oberflächenexpression zur Erleichterung der elektrophysiologischen Charakterisierung der Ionenkanalfunktion von Polycystin-2.

Methoden Das C-terminale ER (endoplasmatisches Retikulum) – Retentionsmotiv des humanen Polycystin-2 wurde deletiert. Das so generierte Konstrukt Polycystin-2 Δ(aa 787-820) wurde mittels Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) hinsichtlich seiner Selektivität für mono- und divalente Kationen charakterisiert und mit zwei etablierten gain-of-function (GOF) Mutanten, F604P und L677A/N681A, verglichen. Die Oberflächenexpression der untersuchten Konstrukte wurde mittels Biotinylierung und anschließendem Western Blot verifiziert. In weiteren Experimenten wurde ein chimärer Kanal (Polycystin-2 Δ(aa 787-820)poreL1), bei dem die Polycystin-2 Pore durch die Pore des Calcium-permeablen Kanals Polycystin-2L1 ausgetauscht wurde, funktionell charakterisiert. Letztere Experimente wurden durch strukturelle Vorhersagen aus einem entsprechenden Homologiemodell ergänzt.

Ergebnisse und Beobachtungen Entzug divalenter Kationen aus der Badlösung erzeugte in Polycystin-2 Δ(aa 787-820)- exprimierenden Oozyten etwa viermal höhere mittlere Natriumeinwärtsströme (I( 100mV) = 0,77 ± 0,06 µA) als in Polycystin-2 WT-exprimierenden Oozyten (I( 100mV) = - 0,19 ± 0,02 µA). Passend dazu war die Oberflächenexpression von Polycystin-2 Δ(aa 787-820) im Vergleich zu Polycystin-2 WT ebenfalls deutlich erhöht. In Ionensubstitutionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Polycystin-2 Δ(aa 787-820) für monovalente Kationen permeabel ist mit einer Präferenz für Kalium im Vergleich zu Natrium oder Lithium. Eine Permeabilität für Calcium konnte nicht nachgewiesen werden. Im Gegenteil inhibierten 0,1mM bzw. 1mM extrazelluläres Calcium die Polycystin-2 Δ(aa 787-820)-vermittelte Natriumeinwärtsströme um 43 ± 2 % bzw. 81 ± 2 %. Weitere Experimente zeigten, dass die Deletion des ER-Retentionsmotivs die Oberflächenexpression der bekannten GOF-Mutanten F604P und L677A/N681A ebenfalls erhöht, ohne deren Selektivität für monovalente Kationen (Kalium > Natrium > Lithium) oder divalente Kationen zu beeinflussen. Diese Befunde legen den Schluss nahe, dass die Deletion des ER-Retentionsmotivs keinen offensichtlichen Einfluss auf die qualitativen Ionenkanaleigenschaften von Polycystin-2 hat. In weiteren Experimenten wurde Polycystin-2 Δ(aa 787-820) dazu verwendet, die Funktion des C-terminalen Calcium-bindenden EF-Hand-Motivs des Kanals zu untersuchen. Um die Bindung von Calcium an das Motiv zu verhindern, wurden die Calcium-koordinierenden Aminosäurereste T771 und E774 zu Alanin mutiert. Überraschenderweise wurden die von Polycystin-2 Δ(aa 787-820) vermittelten Natriumeinwärtsströme durch diese Mutationen nicht beeinflusst (I(-100mV) = - 0,65 µA ± 0,07 µA vs - 0,66 µA ± 0,06 µA). Als Nachweis der Ionenkanalfunktion des Konstrukts wurde die Pore von Polycystin-2 Δ(aa 787-820) mit der von Polycystin-2L1 ausgetauscht. Erwartungsgemäß unterschieden sich die elektrophysiologischen Eigenschaften des resultierenden chimären Kanals Polycystin-2 Δ(aa 787-820)PoreL1 von denen des Polycystin-2 Δ(aa 787-820) und wurden denen von Polycystin-2L1 ähnlich. Wie Polycystin-2L1 ist Polycystin-2 Δ(aa 787-820)PoreL1 für Natrium ähnlich permeabel wie für Kalium und verfügt ebenfalls über eine detektierbare Permeabilität für Calcium.

Schlussfolgerungen und Diskussion In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass ein Polycystin-2 Konstrukt mit deletiertem C-terminalen ER-Retentionsmotiv (Polycystin-2 Δ(aa 787-820)) ausreichend gut an der Zelloberfläche exprimiert wird, um eine elektrophysiologische Charakterisierung zu ermöglichen. Polycystin-2 Δ(aa 787-820) leitet monovalente Kationen, wird hingegen von extrazellulären divalenten Kationen bereits in niedrigen Konzentrationen gehemmt. Die Ionenkanalfunktion des Konstrukts wurde dadurch validiert, dass sich dessen Ionenselektivität durch den Austausch der Pore mit der des verwandten Kanals Polycystin-2L1 verändern ließ. Für zukünftige Untersuchungen könnte Polycystin-2 Δ(aa 787-820) als experimentelles Werkzeug dienen, um pathogene Polycystin-2 Missense-Mutanten funktionell zu charakterisieren und mögliche Aktivatoren und Inhibitoren von Polycystin-2 zu evaluieren.

DOI
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