Die Aktivierung von Suppressorzellen der myeloischen Reihe durch kombinierte Behandlung mit Lipopolysaccharid und Interferon-gamma beeinträchtigt die Entwicklung dendritischer Zellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-12-03
Issue Year
2009
Authors
Greifenberg, Verena
Editor
Abstract

Dendritic cells (DC) and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) are involved in the control of the immune response within tumor diease and infections. Here, MDSC are mainly found in the spleen and bone marrow and barely in lymph nodes. Morphologically, they are divided into monocytic and polymorphonuclear cells. It is not known yet which role MDSC play in healthy, untreated mice. MDSC can be generated from murine bone marrow cells by application of granulocyte/macrophage-colony-stimulating-factor (GM-CSF) and suppress T-cell response in vitro. The cytokine interferon-gamma(IFN-gamma) and nitrogen monoxide (NO) are required for this process. However, further stimulation of bone marrow cells with GM-CSF generates immature DC. Both DC and MDSC stem from immature myeloid precursor cells. So far, it is not resolved which factors regulate the differentiation of these cells to either DC or MDSC. This dissertation aimed for the identification of different subpopulations of MDSC in splenocytes of healthy mice. In addition, the modes of stimulation, activation and the plasticity of MDSC should be analyzed. Therefore, ex vivo isolated splenocytes were characterized with flow cytometry; based on this, different subpopulations were isolated via cell sorting. Their suppressive potential was examined with mixed lymphocyte reaction and measuring of the amount of released NO, cytospins helped to identify their morphology. In vitro generated and ex vivo isolated immature myeloid cells were also characterized with flow cytometry after stimulation of mice and/or cells with different cytokines. In this dissertation it was shown that the combination of IFN-gamma and LPS (bacterial lipopolysaccharide) inhibited further differentiation of in vitro generated MDSC in the most efficient way; in addition, their suppressive activity was induced and enhanced by this treatment. In ex vivo isolated splenocytes of healthy, untreated mice six different subpopulations could be defined regarding surface markers and size/granularity/morphology of the cell; two of them were able to suppress T-cell response: Gr-1high CD11bintermediate cells with ring-shaped nuclei and Gr-1low CD11bintermediate cells with heterogenous morphology. IFN-gamma und LPS did not enhance suppressive activity in splenocytes isolated from healthy mice. However, the additional induction of a specific immune response with endogenous or exogenous DC caused an accumulation of Gr-1+CD11b+ cells in the spleen; hereby the proliferation of T-cells in the spleen was reduced. Furthermore, it was shown that injection of IFN-gamma and LPS inhibited the in vitro differentiation of ex vivo isolated Gr-1+CD11b+ splenocytes into mature DC. In addition, ex vivo isolated CD11b+ splenocytes lost their ability to suppress T-cell response after application of IFN-gamma, LPS and GM-CSF to cell culture. These results suggest that in situations such as chronic inflammation/infection LPS and IFN-gamma both activate the immune response and induce the generation of MDSC in the spleen to avoid exaggerating systemic reactions. Obviously, the specific T-cell response in the regional lymph nodes is not influenced by these processes. These data contribute to a better understanding of the activation of MDSC in vivo. A possible clinical application could be the selective induction or the injection of MDSC to avoid chronical inflammation.

Abstract

Dendritische Zellen (DZ) und myeloide Suppressorzellen (MDSC) sind an der Kontrolle der Immunantwort im Rahmen von Tumoren oder Infektionen beteiligt. Letztere findet man hierbei vor allem in Milz und Knochenmark und kaum in den Lymphknoten und teilt sie morphologisch grob in monozytäre und polymorphkernige Zellen ein. Inwieweit MDSC in gesunden, unbehandelten Mäusen eine Rolle spielen ist bis dato nicht geklärt. Durch Zugabe von GM-CSF (granulocyte/macrophage-colony-stimulating-factor) kann man aus murinen Knochenmarkszellen MDSC kultivieren. Diese supprimieren in vitro die T-Zell-Antwort; hierbei sind u.a. das Zytokin Interferon-gamma (IFN-gamma)und Stickstoffmonoxid (NO) involviert. Eine längere Stimulation der Knochenmarkszellen mit GM-CSF führt hingegen zur Bildung reifer DZ. DZ und MDSC stammen von unreifen myeloiden Vorläuferzellen ab. Bisher ist nicht geklärt, welche Faktoren die Differenzierung dieser Zellen zu entweder DZ oder MDSC regulieren. Diese Arbeit hatte zum Ziel, in Milzzellen gesunder Mäuse verschiedene Subpopulationen der MDSC zu identifizieren und deren Stimulierbarkeit, Aktivität und Plastizität näher zu beleuchten. Hierzu wurden ex vivo isolierte Milzzellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert und daraufhin über verschiedene Zellsortiermethoden diverse Subpopulationen isoliert. Diese wurden mit Hilfe der gemischten Lymphozytenreaktion und Messung des NO-Gehalts auf ihr suppressives Potential und mit Cytospins bezüglich ihrer Morphologie untersucht. Es fanden nach Zytokinbehandlung in Zellkultur und im Mausmodell auch durchflusszytometrische Messungen an in vitro generierten und ex vivo isolierten unreifen myeloiden Zellen statt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Kombination aus IFN-gamma und LPS (bakterielles Lipopolysaccharid) die weitere Differenzierung in vitro generierter MDSC am effektivsten verhindert und zudem deren suppressorische Aktivität induziert und verstärkt. In ex vivo isolierten Milzzellen aus gesunden, unbehandelten Mäusen konnten im Hinblick auf Oberflächenmarker und Zellgröße/-granularität/-morphologie sechs verschiedene Subpopulationen charakterisiert werden; davon waren zwei suppressorisch aktiv: Gr-1highCD11bintermediate Zellen mit ringförmigen Kernen und Gr-1lowCD11bintermediate Zellen mit heterogener Morphologie. IFN-gamma und LPS führten in gesunden Mäusen zu keinem Anstieg der suppressorischen Aktivität bei isolierten Milzzellen. Die zusätzliche Induktion einer spezifischen Immunantwort mittels endogener oder exogener DZ aber bewirkte eine Akkumulation Gr-1+CD11b+ Zellen in der Milz. Dabei wurde die Proliferation Milz-ständiger T-Zellen reduziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Injektion von IFN-gamma und LPS die in vitro-Differenzierung ex vivo isolierter Gr-1+CD11b+ Milzzellen zu reifen DZ verhindert. Ex vivo isolierte CD11b+ Milzzellen verlieren zudem ihre Fähigkeit zur Suppression, wenn sie in Kultur IFN-gamma, LPS und GM-CSF erhalten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass zum Beispiel im Rahmen chronischer Entzündungen/bakterieller Infektionen LPS und IFN-gamma mit der Aktivierung des Immunsystems gleichzeitig die Bildung von MDSC in der Milz induzieren, um überschießende systemische Reaktionen zu vermeiden. Die spezifische T-Zell-Antwort in den regionalen Lymphknoten wird hierbei wohl nicht beeinflusst. Diese Daten tragen zum besseren Verständnis der Aktivierung von MDSC in vivo bei. Durch gezielte Induktion oder Applikation von MDSC könnte so zum Beispiel bei Patienten die Entstehung chronischer Entzündungen verhindert werden.

DOI
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