Analyse der transkriptionellen Regulation des Saccharosetransportergens AtSUC1 in Gametophyten von Arabidopsis thaliana

dc.contributor.advisorSauer, Norbert
dc.contributor.authorNiedermeier, Matthias
dc.date.accessioned2006-03-10
dc.date.available2023-10-15T19:42:55Z
dc.date.created2006
dc.date.issued2006-03-10
dc.description.abstractThe main aspect of this doctoral thesis is the regulation of the very specific AtSUC1 expression pattern in flowers of Arabidopsis thaliana (male gametophyte, connective), especially in the female organs (transmitting tissue, epidermis of placenta and funicles). For this reason analyses with the AtSUC1 promoter were carried out, in order to identify cis regulatory elements. First of all the 3' end of the promoter was identified with the help of 5’ RACE reactions. These experiments showed that the transcription starting site is at position bp –156, that means the 3'end of the promoter is at -157. Deletion experiments with the AtSUC1 promoter and soluble GFP suggested possible binding places for transcription factors in the range of -194 to -360. Beside the known expression pattern of AtSUC1 a new expression site could be detected in the entire female gametophyte. This new expression site proved to be the best marker for the deletion experiments and all further studies. Gel retardation assays with nuclear proteins of freshly pollinated Arabidopsis flowers independently indicated a similar promoter region. First experiments with longer promoter fragments showed reproducibly an interaction between nuclear proteins and DNA for the fragment -155/-421. In more detailed analyses with shorter promoter sequences, it became clear, that shifts could only be observed with fragment 77 (-316/-421) and fragment 78 (-255/-340). In silico analyses with 77 and 78 provided numerous putative trans elements. Most of them would bind within one overlapping region of fragment 78 (multi), whereas two transcritpition factors would interact with clearly from each other separated cis elements in 77 (bZIP, dof). These putative cis elements could be mutated with the help of in vitro mutagenesis and so, in planta, possible changes of the expression pattern of the reporter gene GFP could be examined. The sequence, which 77 and 78 are spanning, was used in a yeast one hybrid experiment. With this two interacting transcription factors could be detected: At2g363270 (ABI5) and At3g56850 (AREB3), which are both ABA responsive and binding to the motive GACACGTGTC; this motive is clearly present in the analysed sequence of the AtSUC1 promoter. As this motive is in the range of the “multi” fragment, already mutated through in vitro mutagenesis, the corresponding plants could directly be examined. It turned out that a mutation of this cis regulatory element leads to a lack of expression of the reporter gene in the female parts (particular female gametophyte), while GFP fluorescence could further on be recognized in the pollen grains and tubes. Promoter::GUS analyses for At2g36270 and At3g56850 demonstrated an almost identical expression pattern to this of AtSUC1. Even in the additionally found expression site of cotelydons an identic pattern of AtSUC1 and both trans factors could be found. With putative ABI5 and/or AREB3 RNAi plants no phanotypic differences could be observed. By default of time no analyses of corresponding transcript levels could be carried out, so these results must be seen as first indications. Recapitulatory it can be said, that in this work two transcription factors - At2g36270 (ABI5) and At3g56850 (AREB3) - were identified, which influence AtSUC1 expression in the female organs (screening marker: female gametophyte).en
dc.description.abstractIn der vorliegenden Arbeit lag das Hauptaugenmerk auf der Regulation des sehr spezifischen AtSUC1 Expressionsmusters in Blüten (männlicher Gametophyt, Konnektiv) und dort insbesondere in den weiblichen Blütenorganen (Durchlassgewebe, Epidermis von Plazenta und Funikuli). Hierfür wurden Analysen mit dem AtSUC1 Promotor durchgeführt, um cis-regulatorische Elemente zu identifizieren. Zur Einengung des interessierenden Bereiches sollte zunächst das 3’Ende des Promotors identifiziert werden. RACE-Reaktionen zeigten, dass der Transkriptionsstart bei bp –156 und demnach das 3’ Ende des Promotors bei –157 liegt. Über Deletionsanalysen mit dem AtSUC1 Promotor und löslichem GFP wurde der Bereich möglicher Bindestellen für Transkriptionsfaktoren auf den Bereich von –194 bis –360 weiter eingegrenzt. Dabei fiel neben dem bisher bekannten Expressionmuster auf, dass AtSUC1 auch im gesamten weiblichen Gametophyt exprimiert wird. Dieser neue Expressionsort erwies sich für die Deletions- und alle weiteren Studien als am besten geeignet. Parallel hierzu unabhängig durchgeführte Gelshift Experimente mit Kernproteinen frisch bestäubter Arabidopsis Blüten deuteten auf einen ähnlichen Abschnitt hin. Erste Untersuchungen mit längeren Promotorbereichen zeigten reproduzierbar eine Interaktion zwischen Kernproteinen und DNA für –155/-421. In detaillierteren Betrachtungen mit kürzeren Promotorsequenzen wurde deutlich, dass ein Shift nur für die Fragmente 77 (-316/-421) und 78 (-255/-340) zu beobachten war. In silico Untersuchungen mit 77 und 78 lieferten zahlreiche potentielle Transkriptionsfaktoren, die allesamt größtenteils überlappend in einem Bereich von 78 binden (multi), daneben zwei Transkriptionsfaktoren, die mit deutlich voneinander getrennten Bindestellen in 77 interagieren könnten (bZIP, dof). Mit Hilfe der gerichteten in vitro Mutagenese war es möglich, diese cis Elemente zu mutieren und so in planta mögliche Veränderungen der Expression des Reportergens GFP zu untersuchen. Der Bereich, den 77 und 78 überspannen, wurde in einem Yeast One Hybrid Experiment eingesetzt. Mit diesem konnten zwei bindende Transkriptionsfaktoren detektiertt werden. Es handelt sich um At2g363270 (ABI5) und At3g56850 (AREB3), zwei ABA-abhängige bZIPS, die an das Motiv GACACGTGTC binden; dieses liegt eindeutig im untersuchten Abschnitt des AtSUC1 Promotors vor. Da das Bindeelement in dem durch in vitro Mutagenese veränderten Bereich mit der Arbeitsbezeichnung multi liegt, konnten die entsprechenden oben aufgeführten Pflanzen direkt herangezogen werden. Es stellte sich heraus, dass eine Mutation des cis-regulatorischen Elementes zu einem Ausbleiben der Expression in den weiblichen Blütenanteilen führt (Screeningmerkmal insbesondere weiblicher Gametophyt), während die GFP-Fluoreszenz in den Pollen weiter aufrecht erhalten war. Promotor-GUS Analysen für At2g36270 und At3g56850 belegten ein nahezu übereinstimmendes Expressionsmuster mit AtSUC1, das sich selbst auf eine zusätzlich gefundene Expression in den Keimblättern erstreckt. Abschließende Untersuchungen von ABI5 bzw. AREB3 RNAi Pflanzen zeigten zwar keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede, jedoch erfolgte aus Zeitgründen keine Kontrolle des Transkriptlevels der beiden Transkriptionsfaktoren, so dass diese Ergebnisse bestenfalls als erste Hinweise gedeutet werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit At2g36270 (ABI5) und At3g56850 (AREB3) eindeutig zwei Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden, die die AtSUC1 Expression in den weiblichen Blütenorganen (Screeningmerkmal insbesondere weiblicher Gametophyt) steuern.de
dc.identifier.opus-id251
dc.identifier.urihttps://open.fau.de/handle/openfau/251
dc.identifier.urnurn:nbn:de:bvb:29-opus-3310
dc.language.isode
dc.subjectABI5
dc.subjectAREB3
dc.subjectAtSUC1
dc.subjectAt2g36270
dc.subjectAt3g56850
dc.subjectgametophyte
dc.subjectsucrose
dc.subjectsucrose carrier
dc.subjecttranscription factor
dc.subjectregulation
dc.subjectabscisic acid
dc.subject.ddcDDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie
dc.titleAnalysis of the transcritional regulation of the AtSUC1 sucrose carrier gene in gametophytes of Arabidopsis thalianaen
dc.titleAnalyse der transkriptionellen Regulation des Saccharosetransportergens AtSUC1 in Gametophyten von Arabidopsis thalianade
dc.typedoctoralthesis
dcterms.publisherFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
local.date.accepted2006-02-06
local.sendToDnbfree*
local.subject.fakultaetNaturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
local.subject.gndSchmalwand <Arabidopsis>
local.subject.gndAckerschmalwand
local.subject.gndSaccharose
local.subject.gndSaccharosestoffwechsel
local.subject.gndPollenschlauch
local.subject.gndBestäubung
local.subject.gndGenregulation
local.subject.gndTranskription <Geneti
local.thesis.grantorFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) Naturwissenschaftliche Fakultät
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