Combination therapy as a promising strategy to overcome drug resistance in colorectal cancer

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2020-02-10
Issue Year
2020
Authors
Ndreshkjana, Benardina
Editor
Abstract

Colorectal cancer tissues comprise a subpopulation of cells, the so-called cancer stem cells (CSCs), that are believed to be responsible for therapy resistance and cancer relapse. Targeting specifically this small population of cells remain a great challenge in colorectal cancer therapy since the available drugs are attacking the bulk of the tumor, leaving intact the stem cell which are tumorigenic and capable to self-renew. Therefore, CSCs represent an attractive target, since it is also known that these cells escape the first line therapy, 5-Fluorouracil (5-FU).

In this PhD work, we present how a novel hybridization approach deriving from the combination of the conventional drug 5-FU with the natural compound Thymoquinone (TQ), can produce a unique hybrid molecule that specifically target this rare subpopulation of cancer cells. Here we have designed, synthesized and evaluated the anti-cancer properties of different hybrid molecules consisting on three different linkers. In parallel, we compared the cytotoxic effects of the hybrid agents with their parental compounds, as well as with the combination of the individual compounds.

The 5-FU/TQ combination therapy and 5-FU/TQ hybridization strategy (SARB hybrid) displayed increased cytotoxicity against colorectal cancer cells, without being toxic to non-malignant HCEC cell or to organoids obtained from normal murine small intestine. NanoString gene expression analysis allowed us to explore the affected genes and pathways upon all the treatments. We could identify overlapping gene signatures but also deregulated pathways exclusively in SARB or in Combi treatment. Notably, two key stem cell controlling pathways, such as WNT/ß-Catenin and PI3K/AKT were simultaneously downregulated after Combi and SARB treatment. In relationship to the individual drug treatments, we found other targets beyond the recognized mechanisms of action of 5-FU and TQ. Additional evidence on proving the capacity of these two combination approaches on targeting stem cell related markers, was the massive downregulation of CD133+ CSC population, which was also accompanied by the striking reduction of self-renewal capacity. The possibility to propagate long-term 3D tumor cell spheres was lost upon SARB treatment, even at sub-toxic doses.

In order to validate our findings also in vivo, the chicken egg model was used. When inoculating the treated HCT116 cells onto the chorioallantoic membrane (CAM) and let them grow into a tumor, we indeed, observed a significant reduction on tumor growth upon SARB administration. The immunohistochemical staining's of CAM-derived xenografts displayed a concomitant nuclear ß-Catenin and E-cadherin staining, data that were in line with the reduced transcriptional activity of ß-Catenin and weakened cell adhesion upon SARB exposure. In comparison to 5-FU, both, Combi and SARB treatment reduced the angiogenic capacity of the residual resistant tumor cells.

Taken together, our results strongly encourage the combination or hybridization of the clinical drug 5-FU and the plant-derived compound TQ as potential candidates that simultaneously target a broader spectrum of oncogenic pathways, eventually leading to a successful eradication of colorectal cancer stem cells.

Abstract

Darmkrebsgewebe bestehen aus einer Subpopulation von Zellen, den sogenannten Krebsstammzellen (CSCs), von denen angenommen wird, dass sie für Therapieresistenz und Krebsrückfall verantwortlich sind. Die gezielte Behandlung dieser kleinen Zellpopulation bleibt eine große Herausforderung bei der Therapie von Darmkrebs, da die verfügbaren Medikamente den Großteil des Tumors angreifen und die tumorerzeugenden Stammzellen intakt lassen, die sich selbst erneuern können. Daher stellen CSCs ein attraktives Ziel dar, da z.B auch bekannt ist, dass diese Zellen der Erstlinientherapie, 5-Fluorouracil (5-FU), entgehen.

In dieser Doktorarbeit stellen wir vor, wie ein neuartiger Hybridisierungsansatz, der sich aus der Kombination des konventionellen Medikaments 5-FU mit der natürlichen Verbindung Thymoquinone (TQ) ableitet, ein einzigartiges Hybridmolekül herstellen kann, das speziell auf diese seltene Subpopulation von Krebszellen abzielt. Dazu haben wir verschiedene Hybridmoleküle, die drei unterschiedliche Linker enthalten, entworfen, synthetisiert und ihre Antikrebseigenschaften analysiert. Parallel dazu haben wir die zytotoxischen Wirkungen der Hybridwirkstoffe mit ihren Ausgangsverbindungen sowie mit der Kombination der einzelnen Verbindungen verglichen.

Die 5-FU/TQ-Kombinationstherapie und die 5-FU/TQ-Hybridisierungsstrategie (SARB-Hybrid) zeigten eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber kolorektalen Krebszellen, ohne für nicht-bösartige HCEC-Zellen oder aus normalem Dünndarm von Mäusen generierte Organoide toxisch zu sein. Die Analyse der NanoString-Genexpression ermöglichte es uns, die betroffenen Gene und Signalwege bei allen Behandlungen zu untersuchen. Wir konnten überlappende Gensignaturen identifizieren, aber auch deregulierte Signalwege ausschließlich bei SARB oder bei der Kombi-Behandlung. Bemerkenswerterweise wurden zwei Schlüsselsignalwege in Stammzellen, wie WNT/ß-Catenin und PI3K/AKT, gleichzeitig nach Combi- und SARB-Behandlung herunterreguliert. In Bezug auf die einzelnen Arzneimittelbehandlungen haben wir andere Ziele gefunden, die über die bekannten Wirkmechanismen von 5-FU und TQ hinausgehen. Ein weiterer Beweis für die Fähigkeit dieser beiden Kombinationsansätze, auf Stammzell-bezogene Marker abzuzielen, war die massive Herunterregulierung der CD133+ CSC-Population, die auch mit einer bemerkenswerten Verringerung der Fähigkeit zur Selbsterneuerung einherging. Die Möglichkeit, sich in langfristigen 3D-Tumorzellspheroide zu vermehren, ging nach SARB-Behandlung auch bei subtoxischen Dosen verloren. Um unsere Ergebnisse auch in vivo zu validieren, wurde das Hühnereimodell verwendet. Beim Inokulieren der behandelten HCT116-Zellen auf die Chorioallantoismembran (CAM) beobachteten wir in der Tat eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums bei Verabreichung von SARB. Die immunhistochemischen Färbungen von CAM-abgeleiteten Xenotransplantaten zeigten eine gleichzeitige nukleare ß-Catenin- und E-Cadherin-Färbung, Daten, die im Einklang mit der verringerten Transkriptionsaktivität von ß-Catenin und der geschwächten Zelladhäsion bei SARB-Exposition standen. Im Vergleich zu 5-FU verringerten sowohl die Combi- als auch die SARB-Behandlung die angiogene Kapazität der verbleibenden resistenten Tumorzellen.

Zusammengenommen fördern unsere Ergebnisse die Kombination oder Hybridisierung des klinischen Arzneimittels 5-FU und der pflanzlichen Verbindung TQ als potenzielle Kandidaten, die gleichzeitig auf ein breiteres Spektrum von onkogenen Signalwegen abzielen und letztendlich zu einer erfolgreichen Eradikation von kolorektalen Krebsstammzellen führen.

DOI
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