Immunregulation durch homotypische T-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-05-07
Issue Year
2010
Authors
Thümmler, Katja
Editor
Abstract

CD4 positive T cells drive specific immune reactions, which are essential for the protection against invading microorganisms. However, they may also have negative effects like tissue damage or autoimmune inflammation. Interestingly, activated CD4 T cells express antigen presenting cell (APC)-specific surface receptors such as CD80, CD86, CD70 and MHC-II, allowing interaction of activated CD4 T cells with resting CD4 T cells. We tested the hypothesis, that homotypic T cell/T cell interaction may induce T cell activation and differentiation from resting T cells. Furthermore, we were interested in the phenotype of the T cells primed by T cell/T cell contact and in the molecular mechanisms underlying this novel kind of cellular interactions. In the first part of the project, we investigated homotypic T cell interaction in vitro. CD4 T cells were isolated from the peripheral blood of healthy donors and activated under different polarizing conditions. The resulting effector cells (stimulators) were fixed and co-cultured together with resting CD4 memory or naive T cells (responders), but in the absence of specific T cell stimulatory factors such as antibodies to T cell surface molecules, antigens or mitogens. After several days of culture, the phenotype and function of the resulting cells were characterized. Co-culture of activated CD4 T cells with resting memory or naive CD4 T cells resulted in the proliferation of memory but not of naive responder cells. Fluorescence microscopic examination of the T cell/T cell interaction revealed the formation of cell clusters of activated T cells surrounded by the responder cells. The memory responder cells not only proliferated in response to contact with activated T cells but also secreted distinct cytokines depending on the polarizing conditions of the activated stimulator T cells. Activated Th1 stimulator cells induced IL-10 and IFNgamma secretion of the memory responder cells in a dose dependent manner, whereas Th2 stimulator cells induced IL-4 secretion. The T cell-induced T cell differentiation was strongly dependent on cell contact. Blocking the adhesion molecule LFA-1 resulted in a profound inhibition of cytokine production and proliferation of the responder cells. Interestingly, however, neutralization of particular adhesion receptors, e.g. ICAM-1, -2 or -3, led to different phenotype alterations of the developing cytokine-producing T cells. Blocking of ICAM-1 diminished production of IFNgamma but did not influence IL-4 and IL-10, whereas ICAM-3 was important for IL-4 secretion, together indicating that ICAM/LFA-1 interaction was not only responsible for the occurrence of T cell/T cell contact but had also a decisive impact on the phenotype of developing cytokine-producing cells. Independent of the polarizing conditions of the stimulator T cells, all T cell populations resulting from T cell/T cell interaction strongly inhibited the proliferation of CD25 negative T cells in a dose dependent manner to a similar extent as natural occurring CD25 positive Tregs. Their inhibitory function could be reverted by exogenous IL-2, and was mediated in part by cell/cell contact and in part by IL-10. The second part of this project was focused on the investigation of the function of T cells generated upon T cell/T cell interaction in vivo. First, the T cell/T cell interaction co-culture system was adapted to murine cells. Similar to the situation in men, resting memory CD4 T cells proliferated in response to contact with activated stimulators and secreted IFNgamma in the co-culture of activated Th1 cells, and IL-4 and IL-10 in the co-culture of Th2 cells. The resulting cell population inhibited the proliferation of CD25 negative T cells in response to anti-CD3 stimulation in a dose dependent manner in vitro. Transfer of cells generated upon T cell/T cell contacts into BALB/c mice reconstituted with DO11.10 OVA-TCR transgenic T cells prevented the expansion of antigen-specific effectors upon antigen challenge, together indicating, that homotypic T cell interaction results in the generation of T cells with a potent regulatory capacity. By this means, effector T cells activated under physiologic conditions may engage a negative feedback mechanism to keep sustained immunity under control and prevent tissue damage.

Abstract

CD4-T-Zellen steuern spezifische Immunreaktionen, die essentiell für den Schutz gegen eindringende Mikroorganismen sind. Dennoch können diese auch negative Effekte wie Gewebeschädigung oder autoimmune Entzündungen hervorrufen. Interessanterweise exprimieren aktivierte CD4-T-Zellen Rezeptoren, welche charakteristisch für Antigen-präsentierende Zellen sind wie z.B. CD80, CD86, CD70 und MHC-II. Diese Rezeptoren ermöglichen Wechselwirkungen von aktivierten CD4-T-Zellen mit ruhenden T-Zellen. Wir untersuchten die Hypothese, dass homotypische T-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen die Aktivierung und Differenzierung von ruhenden T-Zellen induziert. Außerdem interessierten wir uns für den Phänotyp der T-Zellen, die nach Kontakt zu T-Zellen entstehen und die molekularen Mechanismen, die dieser neuen Art von Zell-Wechselwirkungen zu Grunde liegen. Im ersten Teil des Projekts untersuchten wir homotypische T-Zell-Wechselwirkungen in vitro. CD4-T-Zellen wurden aus dem peripheren Blut gesunder Spender isoliert und unter verschiedenen polarisierenden Bedingungen aktiviert. Die sich daraus ergebenden Effektor Zellen (Stimulatoren) wurden fixiert und zusammen mit Gedächtnis- oder Naiven-CD4-Zellen (Responder) in Abwesenheit von spezifischen T-Zell-Stimulanzien, wie Antikörpern gegen T-Zell-Oberflächenmoleküle, Antigenen oder Mitogenen, kokultiviert. Nach einigen Tagen in Kokultur wurden der Phänotyp und die Funktion der entstandenen Zellen analysiert. Die Kokultur der aktivierten CD4-T-Zellen mit ruhenden Gedächtnis-oder Naiven-CD4-T-Zellen löste die Proliferation der Gedächtnis- aber nicht der Naiven-Responder-Zellen aus. Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der T-Zell/T-Zell-Wechselwirkung wurden Zellcluster aus Responder-Zellen gefunden, die von aktivierten T-Zellen umgeben waren. Nach Kontakt mit den aktivierten T-Zellen proliferierten die Gedächtnis-Responder-Zellen nicht nur, sondern sezernierten außerdem bestimmte Zytokine in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter denen die Stimulator-Zellen aktiviert wurden. Aktivierte Th1-Stimulator-Zellen induzierten dosisabhängig bei den Gedächtnis-Responder-Zellen die Sekretion von IL-10 und IFNgamma, während Th2-Stimulator-Zellen zur IL-4 Sekretion führten. Die T-Zell-Differenzierung, die durch Kontakt mit T-Zellen induziert wurde, war stark kontaktabhängig. Die Hemmung des Adhäsionsmoleküls LFA-1 resultierte in einer starken Inhibition der Zytokin-Produktion und Proliferation der Responder-Zellen. Interessanterweise führte jedoch die Blockade bestimmter Adhäsionsrezeptoren, wie ICAM-1,-2 oder -3 zu unterschiedlichen Veränderungen im Phänotyp der sich entwickelnden Zytokin-produzierenden T-Zellen. Die Blockade von ICAM-1 verringerte die IFNgamma-Produktion, hatte allerdings keinen Einfluss auf IL-4 und IL-10, wohingegen ICAM-3 wichtig für die IL-4 Sekretion war. ICAM/LFA-1-Wechselwirkungen scheinen also nicht nur verantwortlich für das Auftreten der T-Zell/T-Zell-Kontakte zu sein, sondern haben auch einen entscheidenden Einfluss auf den Phänotyp der sich entwickelnden Zytokin produzierenden Zellen. Unabhängig von den Bedingungen, unter denen die Stimulator-Zellen aktiviert wurden, inhibierten alle T-Zell-Populationen, die nach T-Zell/T-Zell-Wechselwirkung entstanden waren, dosisabhängig die Proliferation von CD25 negativen T-Zellen ähnlich stark wie CD25 positive regulatorische T-Zellen. Diese Inhibition konnte durch exogenes IL-2 aufgehoben werden und war teilweise kontaktabhängig und teilweise durch IL-10 vermittelt. Der zweite Teil der Arbeit richtete sich auf die Untersuchung der in vivo-Funktion der T-Zellen, die durch T-Zell/T-Zell-Wechselwirkung entstanden. Zunächst wurde das Kokultur System auf die Untersuchung von T-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen bei murine T-Zellen angepasst. Ähnlich wie bei humanen T-Zellen, proliferierten die Gedächtnis-CD4-T-Zellen nach Kontakt mit aktivierten Stimulatoren und sezernierten IFNgamma nach Kokultur mit aktivierten Th1-Zellen, oder IL-4 und IL-10 nach Kokultur mit Th2-Zellen. In vitro inhibierte die resultierende T-Zell-Population dosisabhängig die Proliferation von anti-CD3-stimulierten CD25 negativen T-Zellen. Überträgt man T-Zellen, die durch T-Zell/T-Zell-Wechselwirkung generiert wurden, auf BALB/c Mäuse, die zuvor DO11.10 OVA-TCR transgene T-Zellen erhielten, so verhinderte dies die Expansion der antigenspezifischen Effektor-Zellen nach Antigenkontakt. Zusammengefasst weist dies darauf hin, dass homotypische T-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen T-Zellen mit starker regulatorischer Kapazität hervorbringen. Dadurch erlangen Effektor T-Zellen, die unter physiologischen Bedingungen aktiviert wurden, die Möglichkeit, in einem negativen Feedback-Mechanismus überschießende Immunreaktionen zu kontrollieren und Gewebeschädigungen zu verhindern.

DOI
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