Exploring HIV-1 - Host Cell Interactions using Peptides derived from Human Pegivirus-1, and from Combinatorial Libraries

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2019-01-28
Issue Year
2019
Authors
Hoffmann, Rebecca
Editor
Abstract

Peptides are versatile tools to investigate protein-protein interaction on the amino acid sequence level. The entry to the host cell of HIV-1 is a crucial step of the viral replication cycle. The investigation of inhibitory peptides was a promising starting point to gain further insight into the molecular mechanism of viral host cell entry. Moreover, the characterization of the structural activity of peptides as HIV-1 entry inhibitors contributed to a better understanding of the complex process of HIV-1 entry and its inhibition respectively. During this work two different approaches were pursued. The first approach used a known inhibitory protein-derived peptide (PEGI) as a starting point. The PEGI peptide is derived from the E2 protein of HPgV-1, a non-pathogen human virus, which is a commonly occurring co-infection of HIV-1 infected individuals. Several epidemiological studies showed that a co-infection with HPgV-1 has a positive influence on the outcome parameters of the HIV 1 infection for example disease progression or mortality. The molecular determinants for this phenomenon called viral interference had been studied after the discovery of HPgV-1 in the late 1990s. It has been discovered that the envelope protein (E2), as well as an E2 protein derived peptide are inhibitors of the HIV-1 infection in vitro. One of these peptides was the selected lead sequence for the PEGI peptides of this work. A range of PEGI sequence variants were synthesized and several prerequisite sequence properties for HIV 1 inhibitory activity were determined. The C-terminal negative charge, the hydrophobic core motif and the presence of three cysteines were crucial sequence characteristics for maintaining HIV-1 inhibitory activity. In addition, reduced cysteines instead of a connection via inter- or intramolecular disulfide or lactam bridges were found to be beneficial for HIV-1 inhibitory activity and thus, it can be speculated that redox-active cysteines are involved in the HIV 1 inhibition by PEGI. Moreover, truncation variants revealed a five fold more potent HIV-1 peptide inhibitor (PEGI-D35), which is a promising candidate for follow up studies (Ac LCDCPNGPWVWVPAFCQD-NH2). The PEGI sequence represents a highly conserved motif within the E2 protein with only three flexible positions among the circulating HPgV-1 isolates. The relevance of the PEGI sequence for HPgV-1 isolates was proven by testing a panel of mainly occurring variants of these E2 section and HPgV 1 strain variants, which were inhibitory active. The breadth of HIV-1 inhibition was determined with a HIV-1 strain panel. 4 of 20 tested HIV 1 isolates were resistant against inhibition by PEGI. However, inhibition with IC50 values up to the nanomolar range, depending on the PEGI sensitive HIV-1 isolate, was discovered. The inhibitory activity of PEGI was not limited to a single HIV-1 isolate and PEGI showed the potential of a cross-clade inhibitory peptide. Due to the fact that only R5 tropic HIV-1 isolates were resistant a preference for X4-tropic isolates is indicated. In addition, it could be shown that PEGI sensitive HIV-1 isolates share the same distribution areas as the HPgV-1 subtype 2. The PEGI sequence was initially derived from the E2 protein of a subtype 2 HPgV-1 isolate. Nevertheless, PEGIs activity is not considered to be the only determinant for the observed complex phenomenon of viral interference between HIV-1 and HPgV-1. It can be concluded that PEGI is not a complete functional E2 protein mimic but still provided a mechanism for viral interference on the peptide-protein level. The successful cultivation of a PEGI resistant HIV 1NL4 3 virus and subsequent sequencing of the viral genes discovered five single mutations within gp120, partly located in conserved sections of the protein. Especially the mutation of conserved positions suggested that an important binding site of PEGI is located within gp120. Binding experiments were performed with a set of PEGI peptides to further support this hypothesis. The results outstandingly correlated with the results in HIV-1 neutralization assay. Based on this correlation, gp120 binding of PEGI is a plausible mechanism enabling HIV-1 inhibition. Moreover, it could be shown that PEGI inhibits the binding of gp120 targeting antibodies to their epitope. It was an especially potent inhibitor of the V3 loop antibody F425 B4e8 -gp120 interaction. The inhibition could be narrowed down to the epitope level in binding and HIV-1 neutralization experiments. After a profound analysis of all available results it could be concluded that the PEGIs HIV-1 inhibitory activity is based on binding to gp120, especially the V3 loop, and thereby either directly or indirectly destabilizing crucial gp120 conformation for a successful HIV-1 entry process. The HPgV-1 protein derived peptide PEGI, including its variants, analysis of mode of action and neutralization breadth provided new important insights into to understand the viral interference of HIV-1 and HPgV-1 and HIV 1 inhibition on the protein level. To further support the hypothesized molecular mechanism of HIV-1 inhibition by PEGI, a follow up on the peptide level can be recommended which uses V3 loop sequences of resistant and susceptible HIV-1 isolates. The second approach was the screening of synthetic combinatorial libraries in HIV 1 neutralizing antibody assays. The aim was to identify new peptide sequences that inhibit a designated antibody-protein interaction. 18 scaffold ranking samples of peptide libraries were tested in antibody-protein competitive assays. The following HIV-1 neutralizing antibodies were selected for screening: b12, VRC01, VRC03, three gp120 targeting antibodies, and F240, a gp41 targeting antibody. The screening results proved the suitability of the scaffold ranking to detect active peptide libraries in the field of HIV-1 neutralizing antibodies. A linear D-AA hexapeptide scaffold was selected as a promising candidate to further identify individual peptides which could inhibit the VRC01-gp120HXBc2 interaction. Following the principles for a successful deconvolution, positional scanning samples of the D-AA hexapeptide library were tested. The evaluation of the positional scanning profiles was based on the newly introduced evaluation parameter called fold over X (FOX). FOX enabled the deconvolution of profiles with a moderate level of differentiation. The 24 peptides, selected during the deconvolution process, were synthesized and their ability to inhibit VRC01-gp120HXBc2 interaction was tested. Two active hexapeptides were identified with a high sequence homology of five positions. Both peptides, VRC01-ReH12 (Ac-efvwvy-NH2) and VRC01-ReH11 (Ac-efvwvl-NH2), inhibited the VRC01-gp120HXBc2 binding with moderate inhibitory activity (IC30 = 2 respectively 12 µM), whereas L-AA variants of the active peptides did not show inhibitory activity. The activity was not limited to the VRC01 gp120HXBc2 interaction because both peptides also inhibited the b12- gp120HXBc2 interaction. The identified peptides were the first reported D AA hexapeptide competitors of HIV-1 neutralizing antibodies targeting the CD4 binding site. The testing of positional scanning samples of an active cyclic peptide library can be recommended for further studies to identify new active peptides.

Abstract

Peptide sind vielseitig verwendbare Werkzeuge um Protein-Protein-Interaktionen auf der Aminosäuresequenzebene zu untersuchen. Der Eintritt von HIV-1 in die Wirtszelle ist ein zentraler Schritt innerhalb des viralen Replikationszyklus. Die Untersuchung inhibitorischer Peptide war ein vielversprechender Ausgangpunkt um weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen des viralen Wirtszelleintritts zu gewinnen. Außerdem trug die Charakterisierung der strukturellen Aktivität von peptidischen HIV-1 Inhibitoren zu einem besseren Verständnis des komplexen HIV-1 Eintrittsprozesses sowie zu dessen Inhibition bei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden dafür zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Der erste Ansatz nutzte als Ausgangspunkt ein bekanntes inhibitorisches Peptid (PEGI). Das PEGI Peptid ist von dem E2 Protein des nicht pathogenen Humanvirus HPgV-1 abgeleitet, welches häufig als Co-Infektion von HIV-1 positiven Individuen auftritt. Verschiedene epidemiologische Studien zeigten, dass eine HPgV-1 Co-Infektion einen positiven Einfluss auf Outcome-Parameter der HIV-1 Infektion wie Mortalität und Krankheitsverlauf hat. Nach der Entdeckung von HPgV-1s in den späten 1990er Jahren wurden die molekularen Determinanten für dieses Phänomen, welches als virale Interferenz bezeichnet wird, studiert. Dabei wurde sowohl die Inhibition der HIV-1 Infektion in vitro durch das Hüllprotein (E2 Protein) als auch von E2-Protein-abgeleiteter Peptide entdeckt. Eines dieser Peptide wurde als Leitsequenz für die PEGI Peptide dieser Arbeit ausgewählt. Mit verschiedenen synthetisierten Varianten der PEGI Sequenz wurden grundlegende Sequenzeigenschaften für die inhibitorische Aktivität bestimmt. Die C-terminale negative Ladung, das hydrophobe Kernmotiv und das Vorhandensein von drei Cysteinen waren entscheidende Charakteristiken um die inhibitorische Aktivität zu erhalten. Zudem wurde gezeigt, dass anstatt eine Verbrückung über inter- oder intramolekular Disulfide oder Lactame reduzierte Cysteine vorteilhaft für die inhibitorische Aktivität waren. Somit kann über eine Beteiligung von redox-aktiven Cysteinen an der HIV-1 Inhibition von PEGI spekuliert werden. Außerdem zeigten Verkürzungsvarianten einen fünffach potenteren HIV-1 Peptidinhibitor, welcher ein vielversprechender Kandidat für nachfolgende Untersuchungen ist (Ac LCDCPNGPWVWVPAFCQD-NH2). Die PEGI-Sequenz stellt ein hochkonserviertes Motiv des E2 Proteins mit nur drei variablen Positionen innerhalb zirkulierenden HPgV-1 Isolaten dar. Die Relevanz der PEGI Sequenz für HPgV-1 Isolate wurde mit der Testung eines Sets aus häufig auftretenden Varianten des E2 Proteinabschnitts, die inhibitorisch aktiv waren, belegt. Die Breite der HIV-1 Inhibition wurde mit einer Auswahl von verschiedenen HIV-1 Stämmen bestimmt. 4 von 20 getesteten HIV-1 Isolaten waren gegen die Inhibition durch PEGI resistent. Jedoch wurden bei den PEGI sensitiven HIV-1 Isolaten Inhibitionen mit IC50 Werten bis in den nanomolaren Bereich bestimmt. Die inhibitorische Aktivität von PEGI war nicht auf ein HIV-1 Isolat begrenzt und PEGI zeigte das Potential eines Clade-übergreifenden inhibitorischen Peptids. Eine Präferenz für X4-trope Isolate wurde angedeutet, da nur R5-trope HIV-1 Isolate resistent waren. Zudem konnte gezeigt werden, dass PEGI sensitive HIV-1 Isolate sich das gleiche Verteilungsgebiet mit dem HPgV-1 Subtyp 2 teilen. Die PEGI Sequenz war ursprünglich vom E2 Protein eines HPgV-1 Subtyp 2 Isolats abgeleitet. Trotzdem kann nicht angenommen werden, dass PEGI die einzige Determinante für das beobachtete komplexe Phänomen der viralen Interferenz von HIV-1 und HPgV-1 ist. Es konnte geschlussfolgert werden, dass PEGI kein vollständig funktionales Mimetikum des E2 Proteins ist. Trotzdem wurde ein Mechanismus für die virale Interferenz auf Peptid-Protein Ebene bestimmt. Die erfolgreiche Kultivierung eines PEGI resistenten HIV-1NL4-3-Virus und anschließende Sequenzierung der viralen Gene stellte fünf Einzelmutationen innerhalb des gp120, teilweise in konservierten Bereichen des Proteins, fest. Im Speziellen die Mutationen in konservierten Bereichen ließen vermuten, dass eine wichtige PEGI Bindungsstelle im gp120 lokalisiert ist. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden Bindungsexperimente mit einer Auswahl an PEGI Peptiden durchgeführt. Die Ergebnisse korrelierten bemerkenswert mit den Ergebnissen der durchgeführten HIV 1 Neutralisationsversuche. Auf Grundlage dieser Korrelation ist die Binding von PEGI an gp120 ein plausibler Mechanismus, der die HIV-1 Inhibition ermöglicht. Außerdem konnte gezeigt werden, dass PEGI die Bindung von gp120 adressierender Antikörper an ihr Epitop inhibierte. PEGI war ein besonders potenter Inhibitor der V3 Loop Antikörper F425 B4e8 gp120 Interaktion. Die Inhibition konnte mit Bindungs- und HIV-1 Infektionsexperimenten auf die Epitope Ebene eingegrenzt werden. Nach einer fundierten Analyse aller verfügbaren Ergebnisse konnte geschlussfolgert werden, dass PEGIs inhibitorische Aktivität auf der Binding an gp120, im Speziellen an den V3 Loop, beruht und somit entweder direkt oder indirekt entscheidende gp120 Konformationen für einen erfolgreichen HIV-1 Eintrittsprozess blockiert. Die Analyse der inhibitorischen Aktivität und Breite des HPgV 1 Protein abgeleiteten Peptids PEGI, inklusive seiner Varianten, lieferte neue wichtige Erkenntnisse für das Verständnis der viralen Interferenz von HIV-1 und HPgV-1. Um die Hypothese für den molekularen Mechanismus der HIV-1-Inhibition durch PEGI weiter zu unterstützen, kann eine Weiterverfolgung auf Peptidebene empfohlen werden, bei der V3 Loop-Sequenzen von resistenten und empfindlichen HIV-1-Isolaten verwendet werden.

Der zweite Ansatz war das Screening von kombinatorischen Peptidbibliotheken in HIV-1 neutralisierenden Antikörper Versuchen. Das Ziel war es neue Peptidsequenzen zu identifizieren, die eine bestimmte Antikörper-Protein Interaktion inhibieren. 18 Scaffold Ranking Proben von Peptidbibliotheken wurden in Antikörper-Protein Kompetitionsversuchen getestet. Die folgenden HIV-1 neutralisierenden Antikörper wurden für das Screening ausgewählt: b12, VRC01, VRC03, drei gp120 adressierende Antiköper und F240, ein gp41 adressierender Antikörper. Die Screening Ergebnisse bewiesen die Eignung des Scaffold Rankings für die Detektion von aktiven Peptidbibliotheken in den verwendeten HIV-1 Antikörper Versuchen. Ein lineares D-Aminosäure Hexapeptidgerüst wurde als vielversprechender Kandidat für die folgende Identifizierung einzelner aktiver Peptide, welche die VRC01-gp120HXBc2 Interaktion inhibieren könnten, ausgewählt. Den Grundprinzipien für eine erfolgreiche Dekonvolution folgend, wurden Positionsscreening-Proben der D Aminosäure Hexapeptidbibliothek getestet. Die Auswertung des Positionsscreening Profils beruhte auf dem neu eingeführten Auswertungsparameter, der fold over X (FOX) genannt wurde. FOX ermöglichte die Dekonvolution von Profilen mit moderaten Differenzierungsniveau. Die 24 Peptide, ausgewählt beim Dekonvolutionsprozess, wurden synthetisiert und auf ihre Fähigkeit die VRC01-gp120HXBc2 zu inhibieren getestet. Zwei aktive Hexapeptide mit einer hohen Sequenzhomologie von fünf Positionen wurden identifiziert. Beide Peptide, VRC01-ReH12 (Ac efvwvy-NH2) und VRC01 ReH11 (Ac-efvwvl-NH2), inhibierten die VRC01-gp120HXBc2 mit moderater inhibitorischer Aktivität (IC30 = 2 bzw. 12 µM). L Aminosäure Varianten der aktiven Peptide hingegen inhibierten nicht. Darüber hinaus inhibierten die beiden Peptide nicht nur die VRC01-gp120HXBc2 Interaktion, sondern auch die Interaktion von b12 mit gp120HXBc2. Die identifizierten Peptide waren die ersten beschriebenen D-Aminosäuren Hexapeptidkompetitoren von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern, die die CD4-Bindungsstelle adressieren. Die Untersuchung von Positionsscreening-Proben einer aktiven zyklischen Peptidbibliothek kann für weitere Studien zur Identifizierung neuer aktiver Peptide empfohlen werden.

DOI
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