Crown Ether-Metalloporphyrins as Ditopic Receptors and Pyropheophorbide-a Conjugates for the Photodynamic Therapy of Tumors

Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
Issue Year
Helmreich, Matthias

Starting with motifs obtained in my diploma thesis, the synthesis of the crown ether-porphyrin and the bromomethyl-porphyrin were optimized to obtain both compounds in larger amounts (1-3 g). Complexes of the crown ether-porphyrin with different transition-metals (Zn2+,Co2+/3+, Ni2+, Fe3+, Cd2+) as well as some lanthanoides (Eu3+,Gd3+) were synthesized. The influence of the crown ether on the kinetic stability of the corresponding metalloporphyrins was investigated by the spectroscopic tracing of the exchange of the cadmium center by a zinc metal. Compared to a reference system without an attached crown ether, this exchange reaction takes 3.6 times longer; clearly, a distinct stabilizing effect could be observed. Another part of the thesis dealt with the ditopic properties of the zinc- and the cobalt-porphyrin. By UV/Vis as well as by X-ray crystallography the suitability for binding potassium salts in a ditopic fashion was clearly proven. It was possible to obtain crystal structures of different ditopic complexes. The zinc-KCN-complex and the cobalt-KCN-complex both incorporate the cyanide ion between the zinc or cobalt atom and the potassium center in the crown ether. Contrary to that, the structure of the cobalt system with coordinated potassium thiocyanate shows that the thiocyanate anion is no longer fixed between both metal centers, even though a ditopic binding is existent. As a potential application of such porphyrin-crown ether conjugates, the oxidation of benzylic alcohol to benzaldehyde by using the zinc-porphyrin as a phase-transfer catalyst and solid potassium superoxide as the oxidant was investigated. Because the systems so far reported are not soluble in water, a porphyrin bearing six free carboxylic groups and a crown ether moiety was synthesized. The obtained porphyrin is water-soluble at pH-values >7. The next project was the construction of oligomeric porphyrin-crown ether-conjugates. The combination of bisfunctional porphyrins together with diaza crown ethers led to a library of monomeric building blocks. These compounds offered the possibility for further functionalizations. The selective construction of an oligomeric system where three porphyrin units were connected via two crown ether units was achieved. In the last part of the first section monomeric europium and gadolinium-metallo-porphyrins were synthesized. It was possible to obtain the X-ray structure of the gadolinium porphyrin. In the crystal, the crown ether moiety does not serve as an intramolecular ligand. Instead, a dimer is formed where the crown ether serves as an intermolecular ligand. The development of these novel crown ether-porphyrin conjugates offers interesting chances for further developments. In particular, the field of ditopic receptors can be taken into the aqueous phase. The oligo-porphyrin-crown ether systems mentioned before may lead to new materials with interesting electronic and even magnetic properties. It is also likely that iron or manganese porphyrins which carry crown ethers may act as oxidation catalysts allowing to take advantage of the cheap oxidant potassium superoxide in non-polar solvents. The second section of this thesis dealt with the synthesis of pyropheophorbide-a-fullerene-conjugates as new drug-delivery systems for the photodynamic tumor therapy. Starting from the concept of modular drug carrier systems which comprises of: drug (photosensitizer-pyropheophorbide a) – multiplying unit (fullerene-dendrimer) – addressing unit (antibody). The general idea was to attach a large number of pyropheophorbides to a tumor-affine antibody via a fullerene as multiplying unit. First the development of a reliable method for the isolation of the dye from plant material had to be established. The green algae chlorella turned out to be the best material on a preparative scale and pyropheophorbide-a was obtained in 1-2 g quantities. Comparatively simple systems were synthesized first which combine two pyropheophorbide-a molecules and one fullerene core. The obtained monoadduct was very sensitive towards light and oxygen and the prevailing photophysical process was an electron-transfer and not the generation of singlet oxygen. Therefore a hexakisadduct with drastically reduced electron-accepting properties producing singlet oxygen was synthesized. By introducing a dendritic part between the pyropheophorbide-a moieties and the malonate-unit, it was possible to add six chromophores. The corresponding monoadduct was again very sensitive and an electron-transfer was the prevailing process. Contrary to that, the mixed hexakisadduct was much more stable and had distinctly higher singlet-oxygen-quantum yields. A second strategy to increase the number of attached pyropheophorbide-a moieties abandoned the dendritic part and used the fullerene itself as an octahedral multiplying unit. The addition of six malonates yielded a highly symmetrical hexakisadduct with 12 protected amino-functionalities. Deprotection and successive coupling with pyropheophorbide-a-active ester led to a compound carrying 12 photosensitizers. By the additional insertion of diaminobenzoic acid as a branching unit it was possible to increase the number to 24 photosensitizers. Expanding the successful concept using the fullerene as multiplying unit, a mixed [5:1]-hexakisadduct was synthesized. This species carries 10 pyropheophorbide-a photosensitizers as well as an additional anchor which is necessary for the coupling to the antibody. This compound was coupled to the antibody RITUXIMAB via a bis-NHS-active ester. This antibody selectively addresses the CD20-antigen which is preferentially located on the surface of lymphoma cells. The conjugate was separated by SEC and the successful conjugation was proven by UV/Vis spectroscopy. In preliminary cell culture tests it was shown that the ability of the antibody to recognize the tumor cells is maintained. In order to increase the water-solubility a triethylene glycole unit in position 2a was introdued. As a direct result the solubility in polar solvents was much higher compared to the unsubstituted pyropheophorbide-a. The loss of the vinyl side chain had no effect on the singlet oxygen quantum yields in polar solvents. Importantly, in very polar solvent mixtures like ethanol/water, the 1O2 yields were significantly higher. For all synthesized fullerene-sensitizer-complexes as well as for the corresponding reference systems photophysical investigations were performed by the photobiophysics group of Prof. Dr. Beate RÖDER at the Humboldt-University of Berlin. In vitro cell-experiments with the compounds were performed in the group of Prof. Dr. Fritz BÖHM at the Humboldt-University of Berlin. The cellular uptake as well as the ability to act as a photosensitizer were determined.


Ausgehend von in meiner Diplomarbeit erhaltenen Motiven wurde die Synthese des Kronenether-porphyrins zur Herstellung größere Mengen (1-3 g) optimiert. Anschließend wurden Komplexe des Kronenether-porphyrins mit verschiedenen Nebengruppen-Metallen sowie der Lanthanoide (Zn2+,Co2+/3+, Ni2+, Fe3+, Cd2+, Eu3+ und Gd3+) hergestellt. In kinetischen Experimenten wurde der Einfluß des Kronenethers auf die kinetische Stabilität entsprechender Metalloporphyrine anhand eines Cadmium-Kronenether-Porphyrins untersucht. Hierfür wurde die Austauschreaktion des Cadmium-Zentralmetalls durch Zink UV/Vis-spektroskopisch verfolgt und im Vergleich zum entsprechenden Referenzsystem ohne Kronenether konnte ein deutlich stabilisierender Effekt nachgewiesen werden. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit den ditopischen Eigenschaften des Zink- sowie des Kobalt-Systems. In UV/Vis-Experimenten sowie durch Kristallstrukturanalysen konnte eindeutig die Eignung beider Systeme zur ditopischen Koordination von Kaliumsalzen nachgewiesen werden. Es gelang Kristallstrukturen verschiedener ditopischer Komplexe des Zink- sowie des Kobalt-Systems zu erhalten. Sowohl im Zink-KCN-Komplex sowie im Kobalt-KCN-Komplex wird das Zyanid-Ion fest zwischen dem Zink- bzw. Kobaltatom und dem Kaliumatom im Kronenether eingeschlossen. Im Gegensatz dazu zeigt die Kristallstruktur des Kobalt-Systems mit koordiniertem Kaliumthiocyanat dass, obwohl immer noch eine ditopische Bindung vorliegt, das Thiocyanation nicht mehr zwischen den beiden Metallzentren fixiert vorliegt. Als eine potentielle Anwendung dieser Verbindungsklasse wurde mit Hilfe des Zink-porphyrins als Phasentransfer-Katalysator sowie festem Kaliumsuperoxids die Oxidationsreaktion von Benzylalkohol zu Benzaldehyd in Cyclohexan untersucht. Da die bisher untersuchten Systeme nicht wasserlöslich waren wurde ein System mit sechs freien Carboxylgruppen synthetisiert. Diese Verbindung löst sich in wässriger Umgebung bei pH>7. Ein weiteres Ziel war der Aufbau oligomerer Porphyrin-Kronenether-Konjugate. Durch die Verwendung bisfunktioneller Porphyrine sowie von Diazakronenethern gelang die Synthese einer Bibliothek monomerer Bausteine, welche eine weitere Funktionalisierung zulassen. Es wurde ein Systems aus drei Porphyrin-Einheiten die über zwei Bisazakronenether verbunden sind erhalten. Im letzten Abschnitt wird die Synthese von Europium- und Gadolinium-Metalloporphyrinen beschrieben. Es wurde die Kristallstruktur eines Gadoliniumporphyrins erhalten. Der Kronenether fungiert hierbei als intermolekularer Ligand und es bildet sich ein Dimer aus. Die Erforschung dieser neuen Kronenether-Porphyrin-Konjugate bietet viel Spielraum für weitere Entwicklungen. Vor allem auf dem Gebiet der Ditopischen Rezeptoren eröffnet der Übergang in die wässrige Phase neue Möglichkeiten. Auf dem Gebiet der vorher erwähnten oligo-Porphyrin-Kronenether-Systeme gelingt es vielleicht, neue Materialien mit interessanten elektronischen oder sogar magnetischen Eigenschaften zu finden. Weiterhin ist es vorstellbar, die entsprechenden Kronenether-Eisen oder Mangan-Porphyrine als Oxidations-Katalysatoren einzusetzen. Als Oxidationsmittel in unpolaren Lösungsmitteln währe das billige Kalium Superoxids denkbar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Synthese von Fulleren-Pyrophäophorbid-a-Konjugaten als neue Drug-Delivery-Systeme für die Photodynamische Tumortherapie. Ausgangspunkt war das Konzept des Modularen Carrier-Systems. wobei hierbei als Ziel eine möglichst große Anzahl an Photosensibilisator-Molekülen (Pyrophäophorbid-a) über ein Fulleren als Verzweigungseinheit an einen tumoraffinen Antikörper gebunden werden sollte. Zuerst war es notwendig, eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Pyrophäophorbid-a aus Pflanzen (Spinat, Brennessel, Grünalgen) zu entwickeln. Die Grünalge Chlorella erwies sich als am besten handhabbar und das Pyrophäophorbid a wurde in 1-2 g Mengen erhalten. Als erstes wurden Systeme dargestellt, welche zwei Pyrophäophorbid-a Moleküle gekoppelt an ein Fulleren enthalten. Da das erhaltene Monoaddukt sehr empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff und der primäre photophysikalische Effekt ein Elektronentransfer und nicht die Produktion von Singulett-Sauerstoff war, wurde das entsprechende gemischte Hexakisaddukt synthetisiert. Dieses besitzt nur noch sehr verminderte Elektronenakzeptor-Eigenschaften und produziert Singulett-Sauerstoff. Durch den Einbau einer dendritischen Gruppe zwischen den Pyrophäophorbid-a-Molekülen und der Malonat-Einheit konnte die Zahl der Pyrophäophorbid-a-Substituenten auf sechs erhöht werden. Das entsprechende Monoaddukt war erneut nicht sehr stabil und zeigte einen starken Elektronentransfer als dominierende Reaktion. Das gemischte Hexakisaddukt hingegen, war deutlich stabiler und zeigte relativ hohe Singulett-Sauerstoff-Ausbeuten. Eine zweite Strategie zur Steigerung des Pyrophäophorbid-a-Anteils verzichtete auf den dendritischen Teil und nutzte das Fulleren selbst in Form eines symmetrischen Hexakisadduktes als oktahedrale Verzweigungseinheit. Durch die Verwendung eines Malonsäurebisesters mit terminalen Aminogruppen, wurde ein hochsymmetrisches Hexakisaddukt mit 12 Pyrophäophorbid-a Einheiten erhalten. Unter Verwendung einer Diaminobenzoesäure als zusätzliche Verzweigungseinheit konnte die Zahl der Pyropheophorbid-a-Einheiten auf 24 erhöht werden. Anschließend wurde ein gemischtes [5:1]-Hexakisaddukt synthetisiert, welches neben 10 Pyrophäophorbid-a-Einheiten eine zusätzliche Ankerkette zur Ankopplung eines Antikörpers enthält. Diese Verbindung wurde nun mit dem Antikörper Rituximab verknüpft welcher sich selektiv gegen das auf der Oberfläche von Lymphomzellen vorkommende CD20-Antigen richtet. Nach erfolgter Kopplung wurde das Antikörper-Konjugat über Größenausschluss-Chromatographie gereinigt und die erfolgreiche Bildung des Konjugates konnte über UV/Vis-Spektroskopie nachgewiesen werden. In ersten Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass die Funktion des Antikörpers Tumor-Zellen zu erkennen, erhalten bleibt. Um die Löslichkeit des Pyropheophorbids in Wasser zu erhöhen wurde an der Position 2a eine Trisethylenglykol-Seitenkette eingeführt. Auf die Singulett-Sauerstoff-Ausbeute in unpolaren Lösungsmitteln hatte der Verlust der Vinyl-Seitenkette keinen Einfluss wohingegen im Ethanol-Wasser-Gemisch die Ausbeute sogar deutlich höher war. Alle synthetisierten Fulleren-Sensibilisator-Komplexe sowie die entsprechenden Referenzsysteme wurden im AK Photobiophysik bei Prof. Dr. Beate RÖDER an der Humboldt-Universität zu Berlin auf ihre photophysikalischen Eigenschaften untersucht. Im Arbeitkreis von Prof. Dr. Fritz BÖHM an der Humboldt-Universität zu Berlin wurden mit den synthetisierten Verbindungen Zellversuche durchgeführt. Hierbei wurde die Aufnahme der Verbindungen in die Zellen sowie ihre Eignung als Photosensibilisator zu wirken untersucht.

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