Studien zur Adaptorprotein-Komplex-abhängigen Sortierung von Transmembranproteinen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2021-03-29
Issue Year
2021
Authors
Wollschläger, Paul
Editor
Abstract

Adaptor protein complexes (AP) play an important role in the intracellular sorting processes of the secretory pathway in eukaryotic organisms. Although their role and function in animal cells is well understood, their role and function in plant cells has been little studied to date. Therefore, this work focuses on the analysis of interactions between membrane proteins and AP in Arabidopsis thaliana. The first part of this work concentrated on the iron ion transporters AtNRAMP3 (NRAMP3) and AtNRAMP4 (NRAMP4) and their interaction with AP-4. Both iron ion transporters contain a sorting signal in the N-terminus (di-leucine motif), which is essential for the AP-4-dependent sorting of NRAMP3 and NRAMP4 into the tonoplast. Since no direct interaction of AP-4 with di-leucine motifs is known so far, the first part of this thesis dealt with the detection of a direct interaction between AP-4 and NRAMP3 or NRAMP4. For this purpose, interaction studies were performed using Yeast Two-Hybrid experiments and co-immunoprecipitations. However, interaction between the individual subunits of AP-4 and the N-termini of NRAMP3 or NRAMP4, respectively, could not be detected. The second part of this work dealt with the AP-3-dependent sorting of the sucrose transporter AtSUC4 (SUC4) into the vacuolar membrane. Except for a postulated dileucine motif in the immediate vicinity or within the first transmembrane span, this transporter does not have a distinct sorting signal. In localization studies, AP-3- dependent sorting by the postulated di-leucine motif could be excluded. However, it could be shown that SUC4 has phosphorylatable serines and serine clusters in the cytosolic regions of the N-terminus and VI/VII loop. If these serines are mutated to aspartates by protein mutagenesis, a phosphorylated state of the protein is imitated. This changed the sorting of SUC4 in AP-3-deficient protoplasts. Instead of arranging the native SUC4 protein in the cis-golgi apparatus, the mutated SUC4 protein could leave the cis-golgi apparatus without the presence of AP-3 and be sorted predominantly into the plasma membrane. A closer examination of the serine clusters could not narrow down a minimal motif, but it could be excluded that the change of the protein sequence resulted in a functional acidic cluster, which could function as a sorting motif. In further experiments the S-acyltransferase AtPAT10 (PAT10), which is also sorted by AP-3 into the tonoplast, was tested for a phosphorylatable sorting motif. However, the II/III loop mutated by protein mutagenesis could not produce AP-3-independent sorting.

Abstract

Adaptorprotein-Komplexe spielen eine wichtige Rolle in den intrazellulären Sortierprozessen von eukaryotischen Zellen. Obwohl ihre Rolle und Funktion in tierischen Zellen gut erforscht sind, ist in pflanzlichen Zellen bislang nur wenig bekannt. Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Analyse von Interaktionen zwischen Membranproteinen und Adaptorprotein-Komplexen im Modelorganismus Arabidopsis thaliana. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit den Eisenionentransportern AtNRAMP3 und AtNRAMP4 und deren Interaktion mit dem Adaptorprotein-Kompex AP-4. Beide Eisenionentransporter verfügen im N-Terminus über ein Di-Leucinmotiv, welches maßgeblich für die AP-4-abhängige Sortierung von NRAMP3 und NRAMP4 in den Tonoplast ist. Da bislang keine direkte Interaktion von AP-4 mit Di-Leucinmotiven bekannt ist, befasste sich der erste Teil dieser Arbeit mit dem Nachweis einer direkten Interaktion zwischen AP-4 und NRAMP3 bzw. NRAMP4. Hierfür wurden Interaktionsstudien mit Hilfe von Yeast Two-Hybrid-Versuchen und durch Co- Immunpräzipitationen durchgeführt. Dabei wurde versucht, eine Interaktion zwischen den einzelnen Untereinheiten von AP-4 und den N-Termini von NRAMP3 bzw. NRAMP4 zu zeigen, wobei in beiden Experimenten keine direkte Interaktion festzustellen war. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der AP-3-abhängigen Sortierung des Saccharosetransporters AtSUC4 (SUC4) in die Vakuolenmembran. Dieser verfügt, bis auf ein postuliertes Di-Leucinmotiv in unmittelbarer Nähe bzw. innerhalb der ersten Transmembranspanne, über kein distinktes Sortiersignal. In Lokalisationsstudien konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei dem postulierten Di-Leucinmotiv um ein funktionales Sortiermotiv handelt. Jedoch konnte gezeigt werden, dass SUC4 in den zytosolischen Bereichen des N-Terminus und VI/VII-Loop über phosphorylierbare Serine bzw. Serincluster verfügt. Werden diese Serine durch Proteinmutagenese zu Aspartaten mutiert, wird ein phosphorylierter Zustand des Proteins imitiert. Dadurch änderte sich die Sortierung von SUC4 in AP-3-defizitären Protoplasten. Anstatt, wie das native SUC4- Protein im cis-Golgiapparat zu verbleiben, konnte das mutierte SUC4-Protein in Abwesenheit von AP-3 den cis-Golgiapparat verlassen und überwiegend in die Plasmamembran sortiert werden. Eine genauere Untersuchung der Serincluster konnte kein Minimalmotiv ermitteln, jedoch konnte ausgeschlossen werden, dass durch die Veränderung der Proteinsequenz ein funktioneller saurer Cluster entstanden ist, welcher als Sortiermotiv fungieren könnte. Somit vermittelt die Phosphorylierung des SUC4-N Terminus eine AP-3-unabhängige Sortierung. In weiteren Versuchen wurde die SAcyltransferase AtPAT10 (PAT10), welche ebenfalls durch AP-3 in den Tonoplast sortiert wird, auf ein phosphorylierbares Sortiermotiv überprüft. Der dabei durch Proteinmutagenese mutierte II/III-Loop konnte jedoch keine AP-3-unabhängige Sortierung bewirken.

DOI
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