Entwicklung und Anwendung eines Analyseverfahrens für den qualitativen und quantitativen Nachweis von DNA-Addukten von N,N-Dimethylformamid in Humanurin

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2007-08-27
Issue Year
2007
Authors
Hennebrüder, Kristina
Editor
Abstract

N,N-Dimethylformamide (DMF) is one of the most important organic solvents used in industry. It has been proven to be hepatotoxic, embryotoxic and teratogenic. Therefore it represents a great health risk. DMF has been associated with cancer incidences in the 1980s. However it remains unclear if DMF is carcinogenic or not. Workers are occupationally exposed to DMF during its production and use. The assessment of the individual body burden is a first measure for prevention of health damage. This is particually important in the case of DMF as it is readily absorbed percutaneously and therefore ambient air monitoring might underestimated the uptake. The purpose of this investigation was to reveal if DMF forms DNA-adducts in humans. Since DNA-adducts can be repaired and excreted into urine the first task was to develop an analytical procedure allowing the identification and quantification of DNA-adducts of DMF in urine of occupational exposed persons. After examination of the literature NMC-dC (N4-methylcarbamoyl-2´-deoxycytidine) and NMC-Cyt (N4-methylcarbamoylcytosine) were considered the most probable DNA-adducts to be formed in presence of DMF. These substances were synthesised as standards. An analytical protocol for the identification and quantification of NMC-dC and NMC-Cyt has been successfully developed and validated. It can be summarised as following: Initially an internal isotopically labelled standard (NMC-Cyt*, 2-13C, 1,3-15N) is added to the sample. During acidic hydrolysis NMC-dC is converted to NMC-Cyt in order to determine both adducts in sum and thereby enhancing diagnostic sensitivity. Solid phase extraction with cation exchange resins is used for sample clean-up and concentration of NMC-Cyt. Effective separation of NMC-Cyt and matrix components is achieved by sophisticated two dimensional liquid chromatography. Detection is performed using positive electro spray ionisation and tandem mass spectrometry monitoring transitions of molecule ions to product ions (NMC-Cyt 169 -> 112, NMC-Cyt* 172 -> 115). This allows an unambiguous identification of NMC-Cyt. The obtained analytical procedure has excellent imprecision <5%) and recovery (mean >97%). The detection limit reaches down to 50 pmol/L in human urine. A further task was the application of the analytical procedure in order to determine the DNA-adducts in occupational exposed subjects and to assess background exposure in general population. The newly developed procedure was applied to controll subjects and occupationally to DMF exposed persons. NMC-Cyt could be detected in 22 out of 82 urine samples of occupationally exposed subjects. The concentrations ranged up to 1023 pmol/L. In three positive samples the identity of NMC-Cyt was confirmed by an additional analysis with a second two dimensional liquid chromatography with mass spectrometry detection. The formation of NMC-dC could be proven indirectly by analysis of five positive samples without hydrolysis. No background exposure of NMC-Cyt could be detected in the general population. The obtained data for the biomarkers of DMF for exposed persons should be used to determine which parameter is the most appropriate for biomonitoring of DMF. For the survey of occupational hygiene while handling DMF the parameters NMF and AMCC are recommended. NMF and AMCC reflect the uptake of DMF during a short time due to their half life times of elimination of five and 23 hours, respectively. Haemoglobin-adducts indicate chronic uptake of DMF (120 days). As biochemical effect markers they are especially suited for periodic surveys and health risk assessment of occupationally exposed persons. A DMF-DNA-adduct was detected for the first time in human urine. It enables the assessment of a biochemical effect marker which is closer to the potential carcinogenic effect of a substance than a haemoglobin-adduct. The general application of NMC-Cyt as biomarker has to be further tested. Considering this an improvement of detection limit is desirable so that NMC-Cyt can be assessed in more samples. This improvement can be possibly achieved by employing more sensitive mass spectrometers. The determined DNA-adducts NMC-Cyt and NMC-dC are identical with those formed by methylisocyanate (MIC) in in vitro experiments. Therefore they confirm MIC as intermediate in DMF metabolism. However, it is not yet clear wether MIC directly reacts with DNA or if it binds first to glutathione and the N-methylcarbamoyl function is transfered later.

Abstract

N,N-Dimethylformamid (DMF) ist eines der industriell wichtigsten organischen Lösungsmittel. Seine Hepatotoxizität, Embryotoxizität und Teratogenität sind erwiesen. Somit stellt DMF ein großes gesundheitliches Gefährdungspotential dar. Eine mögliche Kanzerogenität wurde nach Auftreten einiger Krebsfälle in den 1980er Jahren diskutiert, ist aber bislang ungeklärt. Bei der Produktion und insbesondere bei der Verwendung von DMF kommt es zur Exposition von Beschäftigten. Für eine Prävention von Gesundheitsschäden ist als erste Maßnahme die Erfassung der inneren Belastung erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die toxikologisch und arbeitsmedizinisch wichtige Frage geklärt werden, ob es beim Menschen tatsächlich zur Bildung von DNA-Addukten durch DMF kommt. DNA-Addukte können repariert und im Urin ausgeschieden werden. Erstes Ziel dieser Arbeit war deshalb ein Analyseverfahren zu entwickeln, dass die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Addukten von DMF im Urin beruflich exponierter Personen ermöglicht. Nach Auswertung der Literatur war die Bildung der DNA-Addukte NMC-dC (N4-Methylcarbamoyl-2´-deoxycytidin) und NMC-Cyt (N4-Methylcarbamoylcytosin) durch DMF am wahrscheinlichsten. Diese wurden als Standards synthetisiert. Es wurde erfolgreich ein Analyseverfahren für NMC-dC und NMC-Cyt entwickelt und validiert. Nach Zugabe eines isotopenmarkierten internen Standards (NMC-Cyt*, 2-13C, 1,3-15N) erfolgt einleitend die Hydrolyse von NMC-dC zu NMC-Cyt, um die diagnostische Empfindlichkeit zu erhöhen und beide Substanzen in Summe zu erfassen. Durch Festphasenextraktion mit Kationenaustauscher wird die Probe aufgereinigt und NMC-Cyt aufkonzentriert. Mittels einer anspruchsvollen zweidimensionalen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gelingt die effektive Abtrennung von Störkomponenten. Die Detektion erfolgt nach positiver Elektrospray-Ionisation massenspektrometrisch durch Überwachung der Übergänge von Molekül- zu Produktionen (NMC-Cyt m/z 169 -> 112, NMC-Cyt* m/z 172 -> 115). Dies erlaubt einen eindeutigen Nachweis von NMC-Cyt. Das Verfahren zeichnet sich durch sehr gute Impräzision (<5%) und Wiederfindung (Mittelwert >97%) aus. Die Nachweisgrenze des Analyseverfahrens für NMC-Cyt beträgt 50 pmol/L Humanurin. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand in der Anwendung des Verfahrens, um die DNA-Addukte bei DMF-Exposition nachzuweisen und um eine eventuelle Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung zu erfassen. Das neu entwickelte Verfahren wurde daher auf Kontrollpersonen und DMF-exponierte Beschäftigte angewendet. In 22 der 82 Urinproben exponierter Beschäftigter wurde NMC-Cyt nachgewiesen. Die Maximalkonzentration betrug 1023 pmol/L. In drei positiven Proben wurde der Nachweis mittels einer zweiten zweidimensionalen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie qualitativ bestätigt. NMC-Cyt konnte somit zweifelsfrei nachgewiesen werden. Durch Analyse fünf positiver Proben ohne Hydrolyse konnte indirekt die Bildung von NMC-dC bestätigt werden. In der Allgemeinbevölkerung wurde keine Hintergrundbelastung an NMC-Cyt festgestellt. Zur Überwachung der Arbeitshygiene beim Umgang mit DMF empfiehlt sich die Verwendung der Parameter NMF und AMCC, da diese mit Halbwertzeiten der Eliminierung von 5 bzw. 23 Stunden die DMF-Aufnahme innerhalb eines kurzen Zeitraums widerspiegeln. Das erstmalig nachgewiesene DMF-DNA-Addukt NMC-Cyt in Humanurin ermöglicht die Erfassung eines biochemischen Effektmarkers der näher an der potentiell kanzerogenen Wirkung einer Substanz ist als ein Hämoglobin-Addukt Die nachgewiesenen DNA-Addukte NMC-Cyt und NMC-dC, die mit den Addukten von Methylisocyanat (MIC) bei in vitro Versuchen identisch sind, belegen die Bildung von MIC als Intermediat im DMF-Metabolismus. Ungeklärt bleibt, ob MIC direkt mit der DNA reagiert oder ob es nach der Bindung an körpereigenes Glutathion zur Übertragung der NMC-Gruppe kommt. Mit dem Nachweis von NMC-dC und NMC-Cyt gelang erstmalig die qualitative und quantitative Bestimmung von DNA-Addukten von DMF im menschlichen Körper. Die DNA-Addukte belegen, dass DMF genotoxisch ist und über ein mutagenes Potential verfügt. Dies lässt die Vermutung zu, dass DMF über einen genotoxischen Mechanismus Krebs verursachen könnte. Denkbar ist auch, dass das im DMF-Metabolismus gebildete MIC an DNA-Reparaturenzyme bindet, diese blockiert und so indirekt die Entstehung von Krebs fördert.Denkbar ist die Verwendung von NMC-Cyt in molekular epidemiologischen Studien mit dem Ziel einen Zusammenhang zwischen der Bildung des Adduktes und dem Auftreten von Krebsfällen festzustellen.

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