Vergleich der Dynamik von BCR-ABL Transkripten und BCR-ABL DNA-Kopienzahlen unter Imatinibtherapie bei der Chronisch Myeloischen Leukämie

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2023-07-10
Issue Year
2023
Authors
Portner, Judith Felicia
Editor
Abstract

Objectives: The introduction of tyrosine kinase inhibitors (TKI) some decades ago led to great success in the treatment of chronic myeloid leukemia. On the downside, therapy with TKI requires years of medication and undesired side effects can occur, especially in children and young adolescents. Discontinuation of TKI therapy can be possible if the patient achieves sufficient remission, which is currently measured by the number of BCR-ABL1 transcripts. However, this RNA-based method does not allow detection of remaining tumor cells with BCR-ABL1 gene expression but without transcription activity. This thesis is an approach to gain more knowledge about the impact of Imatinib treatment on BCR-ABL1 DNA and RNA copy number in human cells. In addition, we set RNA in relation to DNA to assess transcription activity. Design & Methods: Cell lines K562 and EM2, both carriers of the BCR-ABL1 gene, were incubated with different concentrations of Imatinib together with a BCR-ABL1-negative control. After three days of incubation, cell count was measured by flow cytometry and RNA and DNA isolation was performed. This was followed by droplet digital PCR in order to quantify BCR-ABL1 transcripts and genomic BCR-ABL1. Observations & Results: Cell morphology indicated degradation of cells under treatment with Imatinib, which was supported by a decrease of cell number measured by flow cytometry. The ddPCR results showed a faster decline of RNA transcripts than of DNA copy number. In the case of K562 cells, RNA copy number dropped by 96 % compared with the medium control at the highest concentration, whereas DNA-levels declined by only 38.3 %. Experiments with the cell line EM2 showed similar results. BCR-ABL1 RNA was reduced by 91.6 %, while DNA decreased by 49 %. Summarising, we observed a reduction of transcripts per cell under increasing concentrations of Imatinib. Conclusions: In our experiments, Imatinib had a stronger effect on RNA, while DNA was more stable. Furthermore, cells under TKI therapy had diminished or missing transcription activity. These quiescent cells, which still carry the BCR-ABL1 Gene, cannot be detected by RNA analysis. Therefore, simultaneous measurement of BCR-ABL1 gene copy number may increase the sensitivity to detect minimal residual disease.

Abstract

Hintergrund und Ziele: In der jüngeren Vergangenheit konnten in der Therapie der Chronisch Myeloischen Leukämie (CML) bahnbrechende Erfolge aufgrund der Entwicklung der Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) erzielt werden. Jedoch erforderte eine Therapie mit TKI bisher eine lebenslange Behandlung, wobei besonders bei pädiatrischen Patienten aufgrund der langen Anwendungsdauer ein hohes Potential für unerwünschte Arzneimittelwirkungen gegeben ist. Im Falle einer anhaltenden und ausreichenden Remissionstiefe, die derzeit anhand der Anzahl der BCR-ABL1 Transkripte gemessen wird, ist ein Absetzen des Medikaments möglich. Allerdings können durch die ausschließliche Bestimmung der Transkripte ruhende Tumorzellen mit dem BCR-ABL1 Gen, die keine Transkriptionsaktivität aufweisen, nicht erfasst werden. Ziel dieser Arbeit ist es daher, die Dynamik der Kopienzahlen von DNA und RNA unter Imatinibtherapie anhand eines Zellkulturversuchs zu untersuchen und zu vergleichen. Das Verhältnis von Transkripten zu genomischem BCR-ABL1 gibt zudem Aufschluss über die Transkriptionsaktivität der Zellen unter TKI-Behandlung. Methoden: Für die Experimente wurden die beiden Zelllinien K562 und EM2, die das BCRABL1 Fusionsgen tragen, verwendet und zusammen mit einer BCR-ABL1 negativen Kontrollzelllinie einem Inkubationsansatz mit Imatinib in verschiedenen Konzentrationen unterzogen. Nach der Inkubationszeit wurde die Zellzahl mittels Durchflusszytometrie bestimmt, sowie eine DNA -und RNA-Isolation durchgeführt. Die anschließende Messung der BCR-ABL1 Transkripte bzw. die Bestimmung auf genomischer Ebene erfolgte mittels der Droplet Digital PCR (ddPCR). Ergebnisse und Beobachtungen: Zellmorphologisch zeigte sich deutlicher Zellzerfall, was sich durch einen kontinuierlichen Abfall der Zellzahl unter steigenden Konzentrationen von Imatinib in der Durchflusszytometrie bestätigte. Bei der Droplet Digital PCR war unter ansteigenden Konzentrationen bei beiden Zelllinien ein stärkerer Rückgang der RNA gegenüber der DNA zu verzeichnen. Für die K562-Zelllinie war bei der höchsten Konzentration im Vergleich zur Mediumkontrolle ein Rückgang der BCR-ABL1 Transkripte um 96 %, bei der DNA jedoch nur um 38,2 % zu verzeichnen. In ähnlicher Weise sanken bei der Zelllinie EM2 die Kopien der BCR-ABL1 RNA um 91,6 %, die der DNA um 49 %. Zusammenfassend zeigte sich unter steigenden Konzentrationen von Imatinib eine verminderte Anzahl von Transkripten pro Zelle. Schlussfolgerungen: In den durchgeführten Experimenten ließ sich die DNA besonders in hohen Konzentrationen von Imatinib auf einem stabileren Niveau nachweisen als die RNA. Unter der Behandlung mit TKI zeigten die Tumorzellen eine verminderte bzw. eingestellte Transkriptionsaktivität. Diese ruhenden Zellen mit dem BCR-ABL1 Gen werden also bei der alleinigen Bestimmung der RNA nicht erkannt. Eine parallele Erfassung der BCR-ABL1 positiven Genkopien zusätzlich zur regulär durchgeführten Transkriptmessung kann somit hilfreich sein, um die Resterkrankung besonders im niedrigen Bereich mit höherer Sensitivität zu bestimmen.

DOI
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