Funktionale und molekulare Charakterisierung des akzessorischen HIV 1 Proteins Vpr im Hinblick auf Virus - Wirt Interaktion

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-04-27
Issue Year
2012
Authors
Sörgel, Stefan
Editor
Abstract

The aim of this thesis was to analyze the dependence of the HIV-1 replication on cellular factors. Here, the interaction of viral factors with genetically stable components of the host cell provides considerable targets for antiretroviral therapy. By identification and inhibition of host cellular interaction interfaces it might be possible to circumvent the occurrence of resistant virus variants, as observed in conventional HIV-1 treatment. The accessory HIV-1 protein Vpr interacts with a number of host cell proteins during various stages of virus replication. Furthermore, Vpr is an important factor in the infection of terminally differentiated cells of the monocyte/macrophage lineage. These cell types, among others, form the virus reservoir in patients. For the eradication of the virus from the patient, this reservoir has to be eliminated. The first part of this thesis is based on earlier studies regarding the interaction of HIV-1 CA and the host cell cis/trans peptidyl-prolyl isomerase Cyclophilin A. The HIV-1 replication was examined in the context of the incorporation of Cyclophilin A in budding virions. Here it is shown, that inhibition of the Cyclophilin A - Vpr interaction has no influence on the replication of a Cyclophilin A insensitive HIV-1 mutant. However, a Cyclophilin A sensitive mutant could not be analyzed for its replication in the used cell system. In the second part of this thesis the binding of Vpr to the nuclear envelope was analyzed for its implications regarding the Vpr-induced G2 cell cycle arrest that was postulated to be important for HIV-1 replication. In confocal microscopy studies it was shown that the localization of Vpr at the nuclear envelope is dependent on the activity of host cell caspase 3. The inhibition of caspase 3 lead to the accumulation of Vpr at the nuclear envelope. The increased amount of Vpr at the nuclear envelope selectively augmented the Vpr mediated G2 arrest in T-cells infected with wt HIV-1. Additionally, the sensitivity of Vpr for caspase 3 activity is regulated by the integrity of the N-terminal helix α-1 in Vpr. A reduced apoptosis induction that paralleled with an enhanced G2 arrest function of Vpr upon caspase 3 inhibition is a hint for two distinct functions of the accessory protein. Studies on virion incorporation and the stability of Vpr that were both not altered by inhibitor treatment indicated, that the effect of caspase 3 inhibition is specific for localization of Vpr and apoptosis induction. An influence of caspase 3 inhibition on HIV-1 replication could not be observed, neither in human PBMCs nor in macrophages. In the last part of this thesis the release of HIV-1 from host cells in the context of the L-domain activity regulated by the viral p6 protein was analyzed. First studies confirmed the known effect of rescuing the virus release of a PTAP-L-domain mutant by overexpression of the cellular ALIX protein. This rescue is due to the binding of ALIX to the secondary YPXnL-L-domain in HIV-1 p6 that overlaps with the Vpr binding site. ALIX overexpression recovered virus release and the infectivity of released virions. The mutants generated for the preliminary studies were afterwards successfully cloned in infectious and non-infectious vector systems for ongoing studies. In further studies the function of ALIX in HIV-1 release was analyzed in the context of the host cell E3 ubiquitin ligase POSH. The ubiquitination of ALIX by POSH further increased the effect of ALIX in the HIV-1 release.

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es am Beispiel von HIV-1 die Abhängigkeit der Virusreplikation von zellulären Faktoren zu untersuchen. Die Interaktion viraler Komponenten mit genetisch stabilen Faktoren der Wirtszelle stellt einen bedeutenden Ansatzpunkt für die antiretrovirale Therapie dar. Durch Identifikation und Inhibition zellulärer Schnittstellen können Resistenzbildungen, wie sie in der Behandlung von HIV-1 Infektionen auftreten, vermieden werden. Das akzessorische Protein Vpr stellt in vielen Abschnitten des HIV-1 Replikationszyklus einen Interaktionspunkt zwischen dem Virus und verschiedenen zellulären Komponenten dar und ist daher ein entscheidender Faktor in der Infektion von Zellen der Monozyten/Makrophagen Linie. Diese stellen einen Teil des Virusreservoirs von HIV-1 im Patienten dar, das es zu eliminieren gilt. Der erste Teil dieser Arbeit baut auf vorangegangenen Studien zur Interaktion von HIV-1 CA mit der zellulären peptidyl-prolyl cis/trans Isomerase Cyclophilin A auf. Hier wurde die Replikation von HIV-1 in Zusammenhang mit der Inkorporation von Cyclophilin A in Virionen gebracht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Replikation einer Cyclophilin A insensitiven HIV-1 Mutante durch die fehlende Interaktion von Cyclophilin A mit Vpr nicht weiter verringert wird. Die Replikation einer Cyclophilin A sensitiven Mutante konnte im verwendeten Zellsystem nicht auf den Einfluss der Vpr-Cyclophilin A Interaktion getestet werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Lokalisation von Vpr an der nukleären Membran der Wirtszelle und deren Einfluss auf die Induktion des für die Replikation von HIV-1 notwendigen Zellzyklusarrests in der G2 Phase. Konfokale Mikroskopiestudien belegten, dass die Lokalisation von Vpr an der Kernmembran spezifisch durch die Aktivität der zellulären Caspase 3 gesteuert wird. Eine Inhibition der Caspase 3 hatte die Akkumulation von Vpr an der Kernmembran zur Folge. Die Anreicherung von Vpr an der nukleären Membran in wt HIV-1 infizierten T-Zellen nach Caspase 3 Inhibition führte selektiv zu einer gesteigerten Induktion des Vpr abhängigen G2 Zellzyklusarrests. Die Sensitivität von Vpr gegenüber der Caspase 3 Aktivität steht dabei in Abhängigkeit zu der Integrität der N-terminalen Helix α-1. Eine verringerte Induktion der Apoptose durch Vpr nach Caspase 3 Inhibition bei gleichzeitiger Erhöhung des G2 Zellzyklusarrests propagiert die funktionelle Trennung der beiden Funktionen des akzessorischen Proteins. Der selektive Einfluss der Caspase 3 Inhibition auf die Lokalisation von Vpr und die Apoptoseinduktion wurde durch Versuche zur Stabilität und Virion-Inkorporation von Vpr bestätigt. Beide Funktionen zeigen sich insensitiv gegenüber Inhibitoren von Caspase 3. Eine Auswirkung der Caspase 3 Aktivität auf die HIV-1 Virusreplikation konnte im Zuge dieser Arbeit sowohl in PBMCs als auch in Makrophagen nicht gezeigt werden. Der letzte Teil dieser Arbeit untersucht die Freisetzung neu synthetisierter HIV-1 Partikel aus der Wirtszelle in Abhängigkeit der L-Domänen Aktivität von HIV-1 p6. Durch Überexpression des zellulären Faktors ALIX und dessen Bindung an die sekundäre YPXnL-Domäne, welche mit dem Vpr-Bindemotiv in p6 überlappt, konnte der Phänotyp einer Deletion der primären PTAP-Domäne in HIV 1 revidiert und somit dieser Mechanismus bestätigt werden. Die Virusfreisetzung und Infektiosität der Mutante waren nach ALIX Überexpression annähernd vergleichbar mit der Wildtyp Variante. Die in den Vorversuchen generierten und getesteten Mutanten konnten anschließend in infektiöse und nicht infektiöse Vektorsysteme kloniert werden. In weiterführenden Versuchen wurde die Funktion von ALIX in der HIV-1 Freisetzung in Abhängigkeit zu der zellulären RING Finger E3 Ubiquitinligase POSH gebracht. Durch Ubiquitinylierung von ALIX durch POSH wurde der Effekt von ALIX auf die Virusfreisetzung einer HIV-1ΔPTAP Mutante deutlich verstärkt.

DOI
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