CSPG4-specific CAR T cells for high-risk childhood B cell precursor leukemia

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2020-05-04
Issue Year
2020
Authors
Harrer, Dennis
Editor
Abstract

Hintergrund und Ziele: Mit der Entwicklung von CD19-spezifischen CAR-T-Zellen (chimeric antigen receptor T-Zellen) ist das Arsenal der Krebsimmuntherapie für die akute lymphatische Leukämie (ALL) und das diffus-großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) um eine neue erfolgsversprechende Therapiemodalität erweitert worden. Die Besonderheit der chimären Antigenrezeptoren (CARs) besteht darin, dass sie nach dem Einbau in T-Zellen antigenspezifisch an Oberflächenmoleküle von Krebszellen binden und nachfolgend eine T-Zellaktivierung induzieren können, die zur Zerstörung der gebundenen Krebszellen führt. Synthetisiert werden diese CARs durch die Fusion des intrazellulären Teils des T-Zell-Rezeptors mit der Antigenbindungsdomäne von tumorspezifischen Antikörpern. Das Auftreten einer Reihe von Leukämierezidiven gekennzeichnet durch CD19-negative Krebszellen nach initial erfolgreicher Therapie mit CD19-spezifischen CAR-T-Zellen akzentuiert die Relevanz der Suche nach Ersatzantigenen für CD19. Ein mögliches Ersatzantigen ist das Transmembranprotein Chondroitinsulfat Proteoglykan 4 (CSPG4), das vornehmlich auf Leukämiezellen nachgewiesen wurde, die eine prognostisch ungünstige Alteration des MLL (mixed-lineage-leukemia)-Gens im Lokus 11q23 aufweisen. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einsatz von CSPG4-spezifischen CAR-T-Zellen gegen leukämische Blasten zu erforschen, die Veränderungen im MLL-Gen aufweisen. Als Modell diente die pädiatrischen Hochrisiko B-Zell Vorläufer Leukämie Zelllinie KOPN8 (MLL-MLLT1 Translokation). Methoden: Die CSPG4-Expression auf den verwendeten Zelllinien T2.A1 (TxB Zell Hybridom), A375M (Melanomzelllinie) und KOPN8 (B-Zellvorläufer-Leukämiezelllinie mit MLL-MLLT1-Translokation) wurde durchflusszytometrisch mit einem CSPG4-spezifischen Antikörper (Klon: 9.2.27) analysiert. Für die Generierung von CSPG4-spezifischen CAR-T-Zellen wurden T-Zellen zuerst selektiv durch die Stimulation mit einem monoklonalen Antikörper (Klon: OKT3) gegen die CD3 Komponente des T-Zell-Rezeptors und IL-2 aus monozytendepletierten PBMZs (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) expandiert. Anschließend wurden diese T-Zellen mit mRNA, die für einen CSPG4-spezifischen CAR mit CD28-Kostimulation kodierte, elektroporiert. Als Negativkontrollen fungierten ohne RNA elektroporierte T-Zellen und T-Zellen, die mit einem analog aufgebauten CAR gegen das Kontrollantigen CEA (Carcinoembryonales Antigen) transfiziert wurden. Danach wurden die verschiedenen T-Zell-Konditionen mit KOPN8 Zellen ko-inkubiert, und verschiedene T-Zell-Effektorfunktionen analysiert. Die Expression von Aktivierungsmarkern, die Zytokinsekretion und die Degranulationsaktivität wurden durchflusszytometrisch erfasst. Die Zytotoxizität wurde mit einem Chrom-Lyse-Test ermittelt. T2.A1 Zellen fungierten als Negativkontrollen und A375M Zellen als Positivkontrollen für antigenspezifische T-Zellaktivität.
Ergebnisse und Beobachtungen: Durch Färbung mit dem CSPG4-spezifischen Antikörper 9.2.27 sowie dem CEA-spezifischen Antikörper B1.1/CD66 konnte auf den KOPN8 Zellen eine uniforme CSPG4-Expression und ein geringfügige CEA-Expression im Vergleich zur Isotyp-Kontrolle demonstriert werden. Die T2.A1 Zellen waren sowohl CSPG4 als auch CEA negativ. Die A375M Zellen waren CSPG4 positiv und CEA negativ. Mittels selektiver T-Zellexpansion basierend auf OKT3 und IL-2 Stimulation konnte eine homogene CD3-postive T-Zellpopulation amplifiziert werden, die überwiegend aus CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen bestand. Nach der CAR-Transfektion wurde sowohl der CSPG4-CAR als auch der CEA-CAR von mehr als 80% der eingesetzten T-Zellen exprimiert. Nach einer Ko-Kultur mit KOPN8 Zellen zeigten CSPG4-CAR-T-Zellen im Vergleich zu ohne RNA transfizierten T-Zellen und CEA-CAR-T-Zellen eine signifikante antigenspezifische Induktion der Aktivierungsmarker CD25 und CD69. Ferner sezernierten CSPG4-CAR-T-Zellen antigenspezifisch signifikant mehr TNF und IFNγ als ohne RNA transfizierte und CEA-CAR-T-Zellen nach Ko-Inkubation mit KOPN8 Zellen. Schließlich konnte demonstriert werden, dass CSPG4-CAR-T-Zellen spezifische zytotoxische Effekte gegen KOPN8 Zellen bewirken können, die sich in einer signifikanten antigenspezifischen Degranulation sowie in einer antigenspezifischen Lyse der Leukämiezellen manifestierten. CSPG4-negative T2.A1 Zellen wurden nicht lysiert.
Schlussfolgerung: CSPG4 ist ein etabliertes Zielantigen in der CAR-T-Zelltherapie des Melanoms. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CSPG4-CAR-T-Zellen auch für die CAR-T-Zelltherapie pädiatrischer Hochrisiko-B-Zellvorläuferleukämien mit Alterationen im MLL-Gen Verwendung finden könnten.

DOI
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