Interplay of DAPK signalling pathway with LIMK/cofilin complex in TNF-inducedapoptosis in HCT116 colorectal cancer cells

dc.contributor.advisorSlany, Robert
dc.contributor.authorIvanovska, Jelena
dc.date.accessioned2013-06-05
dc.date.available2023-10-15T19:52:38Z
dc.date.created2013
dc.date.issued2013-06-05
dc.description.abstractThe PhD thesis aimed to characterize cytoskeletal alterations in TNF-induced apoptosis on the biochemical and molecular level. In the focus of the experiments was the pro-apoptotic protein kinase DAPK (death-associated protein kinase) that is a cytoskeleton-associated Ca2+/calmodulin-regulated serine/threonine kinase. In the past, our group reported that colorectal cancer cells show a DAPK-dependent caspase3-mediated apoptosis under TNF stimulus. Application of a phospho-peptide array analysis revealed a number of new phosphorylated cytoskeleton-associated proteins after TNF-treatment in colorectal cancer cells. Among them, p-cofilinSer3 was 3.3-fold up-regulated. Using knockdown (siRNA) and exogenous overexpression methods LIM kinase was identified as the responsible upstream kinase. For the first time we showed that these three proteins: DAPK1/LIMK1/cofilin1 form a pro-apoptotic multi-protein complex that is reinforced under TNF stimulus. In the next step we aimed to better understand the role of p-cofilinSer3 in apoptosis. Interestingly, p-cofilinSer3 levels were increased in apoptotic cells with condensed chromatin, pronounced membrane blebs and Annexin V up-regulation. Furthermore, dead, non-adherent (floating), paxillin negative cells showed remarkably high levels of p-cofilinSer3 and active caspase3. By varying the cofilin phosphorylation level using site directed mutagenesis, we demonstrated that the expression of the pseudophosphorylated (cofilinGlu3 and cofilinAsp3) and nonphosphorylatable cofilinAla3 mutant did not significantly alter TNF-induced apoptosis in comparison with cofilin wild type expression. From these experiments we suggested that p-cofilinSer3 is an indicator but not a trigger of TNF-induced apoptosis significantly up-regulated in detached cells that committed to apoptosis. We further investigated the role of DAPK in this complex. We studied the effect of DAPK inhibition and knockdown on the phosphorylation status of LIMK and cofilin under TNF. After inhibition of the catalytic activity of DAPK by a new specific DAPK inhibitor, the LIMK and p-cofilinSer3 phosphorylation was diminished. In parallel, the levels of p-cofilinSer3 and p-LIMKThr508 proteins were also reduced after DAPK siRNA knockdown experiments. Therefore, we propose a 3D structural model where DAPK functions as a scaffold for the LIMK/cofilin complex. In the next part of this study we investigated mitotic catastrophe as a type of TNF-induced cell death. Our results revealed that TNF induces structural and numerical chromosomal instabilities in colorectal tumor cells as well as a decreased mitotic index. Results from dual-color FISH showed an increased number of polyploid HCT116 cells after TNF-treatment. We assumed that there is a defective G2/M checkpoint control (DNA structure checkpoint) allowing progress from G2 to the M phase of the cell cycle which could promote polyploidy. This has to be studied in more detail. Finally, we analysed samples of colorectal cancer patients in tissue microarrays immunohistochemically stained for p-cofilinSer3 and DAPK. In contrast to the well-known function of DAPK as a tumor suppressor, DAPK up-regulation was identified as an adverse prognostic factor. It was correlated with right-sided tumors, significantly lower number of iTILs (tumor infiltrating lymphocytes) and tumors with lymphatic and vascular invasion. In addition the 5-year survival rate was significantly reduced in comparison to DAPK loss tumors (25.6% versus 52.3% respectively). There was no correlation between DAPK and p-cofilinSer3 protein expression. Accordingly, p-cofilinSer3 protein expression did not correlate with any of the clinico-pathologic factors. This interesting and new finding has to be further evaluated.en
dc.description.abstractZiel dieser Doktorarbeit war es, Veränderungen des Zytoskeletts während der TNF-induzierten Apoptose zu charakterisieren. Im Fokus der Experimente stand die pro-apoptotische Proteinkinase DAPK (death-associated protein kinase), eine zytoskelett-assoziierte, Ca2+/Calmodulin-regulierte Serin/Threonin-Kinase. Unsere Gruppe hat bereits gezeigt, dass kolorektale Tumorzellen unter TNF-Stimulus DAPK-abhängig und Caspase3-vermittelt in Apoptose gehen. Durch einen Phospho-Peptid-Array fanden wir nach TNF-Behandlung neue phosphorylierte, zytoskelett-assoziierte Proteine in kolorektalen Tumorzellen. Das Protein p-CofilinSer3 war 3,3-fach hochreguliert und daher besonders interessant. Mittels Knockdown (siRNA) und Überexpression, konnten wir LIMK1 als verantwortliche upstream Kinase identifizieren. Zum ersten Mal zeigten wir, dass diese drei Proteine – DAPK, LIMK1 und Cofilin1 – einen pro-apoptotischen Multiprotein-Komplex bilden, der unter TNF-Behandlung stabilisiert wird. Im nächsten Schritt wollten wir die Rolle von p-CofilinSer3 in der Apoptose besser verstehen. Interessanterweise, lag die Konzentration von p-CofilinSer3 höher in Zellen mit kondensiertem Chromatin, ausgeprägtem Membran-Blebbing und positiver Annexin-V-Färbung. Darüber hinaus zeigten tote, Paxillin-negative Zellen, die ihre Adhärenz zur Kulturplatte verloren hatten, hohe Konzentrationen an p-CofilinSer3 und aktiver Caspase3. Indem wir mittels p-CofilinSer3¬-Mutanten die Phosphorylierung von Cofilin veränderten, konnten wir zeigen, dass die Expression der pseudo-phosphorylierten (CofilinGlu3 und CofilinAsp3) sowie der nicht phosphorylierbaren Mutante CofilinAla3 die TNF-induzierte Apoptose nicht signifikant veränderte, im Vergleich zur Expression mit dem Cofilin-Wildtypvektor. Aus diesen Experimenten schlossen wir, dass p-CofilinSer3 eher ein Indikator und nicht ein Auslöser der TNF-induzierten Apoptose ist, und in nicht mehr adherent wachsenden Zellen signifikant hochreguliert ist. Außerdem erforschten wir die Rolle von DAPK in diesem Komplex. Wir untersuchten die Auswirkungen einer DAPK-Inhibition und eines -Knockdown auf den Phosphorylierungsstatus von LIMK und Cofilin unter TNF-Einfluss. Nach Hemmung der katalytischen Aktivität von DAPK durch einen neuen DAPK-Inhibitor, war die Phosphorylierung von LIMK und CofilinSer3 vermindert. Parallel dazu war die Phosphorylierung von CofilinSer3 und LIMKThr508 nach DAPK siRNA-Knockdown-Experimenten ebenfalls verringert. Daher schlagen wir ein strukturelles 3D-Modell vor, in dem DAPK als stabilisierendes Gerüst für den LIMK/Cofilin-Komplex dient. Im nächsten Teil dieser Studie untersuchten wir die Mitotische Katastrophe als eine Art des TNF-induzierten Zelltods. Unsere Ergebnisse zeigten, dass TNF die strukturelle und chromosomale Stabilität von kolorektalen Tumorzellen stört, ebenso führt es zu einem erniedrigten mitotischen Index. Die Ergebnisse einer Zwei-Farben-FISH zeigten eine erhöhte Anzahl polyploider HCT116 Zellen nach TNF-Behandlung. Unsere Vermutung ist daher, dass ein Defekt in der G2/M-Checkpoint-Kontrolle (DNA-Struktur-Checkpoint) vorliegt. Dies würde den Übergang von G2 in die M-Phase erlauben und könnte zur Polyploidie führen. Künftige Studien müssen das klären. Schließlich haben wir Proben von Patienten mit kolorektalen Tumoren untersucht. Die Proben haben wir in Gewebe-Microarrays immunhistochemisch gegen p-CofilinSer3 und DAPK gefärbt. Im Gegensatz zur bekannten Funktion von DAPK als Tumorsuppressor konnten wir eine DAPK-Überexpression als einen ungünstigen prognostischen Faktor identifizieren. Diese Überexpression korrelierte mit rechtsseitigen Tumoren, einer signifikant verringerten Tumorinfiltration von Lymphozyten, sowie mit Tumoren mit lymphatischer und vaskulärer Invasion. Zusätzlich war die 5-Jahres-Überlebensrate signifikant verringert im Vergleich zu Tumoren mit DAPK Verlust (25,6% gegenüber 52,3%). Es gab keinen Zusammenhang zwischen der DAPK und der p-CofilinSer3 Expression. Dem entsprechend korrelierte die p-CofilinSer3 Expression mit keinem der klinisch-pathologischen Faktoren. Dieses neue und interessante Ergebnis muss weiter untersucht werden.de
dc.identifier.opus-id3385
dc.identifier.urihttps://open.fau.de/handle/openfau/3385
dc.identifier.urnurn:nbn:de:bvb:29-opus-46853
dc.language.isoen
dc.subjectDAPK
dc.subjectLIMK
dc.subjectTNF
dc.subjectApoptosis
dc.subjectCofilin
dc.subjectLIMK
dc.subject.ddcDDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 50 Naturwissenschaften :: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.titleInterplay of DAPK signalling pathway with LIMK/cofilin complex in TNF-inducedapoptosis in HCT116 colorectal cancer cellsen
dc.titleZusammenspiel des DAPK-Signalweges mit dem LIMK/cofilin-Komplex in der TNF-induzierten Apoptose in HCT116 Darmkrebszellende
dc.typedoctoralthesis
dcterms.publisherFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
local.date.accepted2013-05-07
local.sendToDnbfree*
local.subject.fakultaetNaturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
local.subject.gndApoptosis
local.subject.gndCofilin
local.subject.gndTumor-Nekrose-Faktor
local.thesis.grantorFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) Naturwissenschaftliche Fakultät
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