Die Aktivität der sauren Sphingomyelinase wird im Zellkulturmodell durch Zelldichte reguliert

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-04-15
Issue Year
2012
Authors
Bode, Jens
Editor
Abstract
  1. Background and aims Acid sphingomyelinase (ASM) is an enzyme, which catalyses the cleavage of sphingomyelin into ceramide and phosphorylcholine. It is of particular scientific interest because it plays a major role in the pathogenesis of many diseases and conditions in internal medicine, psychiatry and oncology via its product, the proapoptotically active sphingolipid ceramide. ASM regulates the cellular concentration of ceramide by which it influences, among other effects, the equilibrium of proliferation and apoptosis. The activity of ASM is controlled by different mechanisms and can, already today, be downregulated pharmacologically. To study the physiology and pathophysiology of ASM and the possibility of pharmacological interference, cell culture models are commonly used. In cell culture, all factors that can influence the sphingolipid metabolism must be taken into account. The aim of this study is to investigate the effect that the degree of confluence in cell culture has on the activity of ASM. 2. Materials and methods To investigate the influence of confluence on the activity of ASM in the culture of different cell lines, one murine and four human cell lines were cultured in different cell-densities. After three days in culture, confluency values of 25 % to > 150 % were reached. After lysis of the cells, protein concentration was determined and the enzymatic activity of ASM was measured. In addition, in two cell lines the expression of mRNA coding for ASM was quantified by qPCR. 3. Results A clear effect of the culture conditions on acid sphingomyelinase was detected. The activity of ASM was influenced by cellular density in all cell lines. Four of the cell lines showed a significant and continuous increase in ASM-activity contingent upon the cell density. In the neuroglioma cell line H4, an increase in ASM-mRNA-expression, contingent upon the cell density, was found. By contrast, in the adenocarcinoma cell line HeLa, ASM-activity increased without a simultaneous rise of ASM-mRNA-expression. 4. Conclusion The current findings show that the influence of the degree of cellular confluence must be considered in any research on sphingolipid metabolism. Investigations on ASM activity can yield valid results only when the experiments are performed at equal cell density. From a clinical perspective, the observed connection offers the prospect of new insights into the pathophysiology of tumours. All cells examined in this study have been isolated from tumours and are characterized by unlimited proliferation even at high cell densities. Against expectations increased ASM activity does not seem to cause growth inhibition via increased intracellular ceramideconcentration. This characteristic of tumour cells could point towards a new mechanism, by which these cells avoid apoptosis through contact inhibition.
Abstract
  1. Hintergrund und Ziele Die saure Sphingomyelinase (ASM) ist ein Enzym, welches die Spaltung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin katalysiert. Sie ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil sie über ihr Produkt, das proapoptotisch wirksame Sphingolipid Ceramid, maßgeblich an der Pathophysiologie diverser internistischer, psychiatrischer und onkologischer Krankheitsbilder Anteil hat. Die ASM reguliert die zelluläre Ceramid-Konzentration und nimmt damit unter anderem Einfluss auf das Gleichgewicht von Proliferation und Apoptose. Die Aktivität der ASM wird durch unterschiedliche Regulationsmechanismen kontrolliert und kann schon heute medikamentös gehemmt werden. Zur weiteren Aufklärung der Physiologie, Pathophysiologie und der pharmakologischen Beeinflussbarkeit der ASM, kommen häufig Zellkulturmodelle zum Einsatz. Dabei müssen alle Faktoren Berücksichtigung finden, die Auswirkung auf den Sphingolipidstoffwechsel haben können. Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss des Konfluenzgrades von Zellen in Kultur auf die Aktivität der ASM zu untersuchen. 2. Material und Methoden Um zu erforschen, welchen Einfluss die Konfluenz bei der Kultur unterschiedlicher Zelllinien auf die Aktivität der ASM hat, wurden eine murine und vier humane Zelllinien in unterschiedlichen Zelldichten kultiviert. Nach drei Tagen in Kultur ergaben sich Konfluenzwerte von 25 % bis > 150 %. Nach der Lyse der Zellen, wurde die Proteinkonzentration in den Lysaten bestimmt und die enzymatische Aktivität der ASM gemessen. In zwei Zelllinien wurde zusätzlich die Expression der für die ASM kodierenden mRNA durch qPCR quantifiziert. 3. Ergebnisse Es konnte ein eindeutiger Einfluss der Kulturbedingungen auf die saure Sphingomyelinase festgestellt werden. Die Aktivität der ASM wurde in allen untersuchten Zelllinien durch die Dichte der Zellen beeinflusst. Vier Zelllinien zeigten einen signifikanten und stetigen Anstieg der ASM-Aktivität in Abhängigkeit von der Zelldichte. In der Neurogliomzelllinie H4 wurde abhängig von der Zelldichte, eine erhöhte ASM-mRNA-Expression festgestellt, die mit der Erhöhung der ASM-Aktivität korreliert. Im Gegensatz dazu stieg bei der Adenokarzinomzelllinie HeLa die ASM-Aktivität ohne gleichzeitigen Anstieg der ASM-mRNA-Expression. 4. Praktische Schlussfolgerungen Die hier demonstrierten Befunde zeigen, dass zur Erforschung des Sphingolipidstoffwechsels Einflüsse durch den Konfluenzgrad der Zellen Beachtung finden müssen. Untersuchungen zur Aktivität der ASM können nur zu validen Ergebnissen führen, wenn die Experimente stets bei vergleichbaren Zelldichten durchgeführt werden. Aus klinischer Sicht stellt der gezeigte Zusammenhang neue Erkenntnisse für die Pathophysiologie von Tumorleiden in Aussicht. Alle in dieser Arbeit untersuchten Zellen wurden aus Tumoren isoliert und zeichnen sich selbst bei hohen Zelldichten durch uneingeschränkte Proliferation aus. Erhöhte ASM-Aktivität scheint in den untersuchten Zelllinien wider Erwarten keine Wachstumshemmung durch erhöhte intrazelluläre Ceramid-Konzentration zu verursachen. Diese Eigenschaft von Tumorzellen könnte auf einen neuen Mechanismus hinweisen, wie diese Zellen Apoptose durch Kontaktinhibition verhindern.
DOI
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