Induktorerkennung und Allosterie des Tet Repressors

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2006-01-27
Issue Year
2005
Authors
Henßler, Eva-Maria
Editor
Abstract

TetR is a transcriptional regulator protein responsible for regulation of tetracycline resistance determinants in prokaryotes. Because of its highly specific binding to tet Operator and of the inducer tetracycline, the TetR System is widely used for gene regulation in prokaryotes, as well as in eukaryotes. Removal of the 4-dimethylamino grouping from tetracycline results in loss of TetR inducibility. A mutant of the tetracycline inducible repressor protein TetR was constructed, showing specificity for the tc analog 4-ddma, which lacks the 4-dimethylamino moiety. The relaxed specificity mutant TetRi1 (H64K S135L) displays reduced induction by tc but full induction by dox, atc and 4-ddma. To create induction specificity for tc derivatives lacking the 4-dimethylamino grouping like 4-ddma the residues which are located close to that moiety in the crystal structure of the TetR-[tc-Mg]+2 complex, were randomized in TetR and TetRi1, because a residue with increased size may lead to sterical hindrance for tetracyclines carrying the 4-dimethylamino function. Out of 43 exchanges the addition of S138I to TetR H64K S135L yielded a mutant (TetRi2) with the desired phenotype. In vivo and in vitro analyses suggest that S138I introduces a sterical hindrance for tc derivatives carrying the 4-dma function. The binding constants revealed 440-fold increased [4-ddma-Mg]+ binding and 3 x 107-fold decreased [atc-Mg]+ affinity compared to the wildtype. The contributions of each single mutant to specificity indicate that 4-ddma binds a slightly different position in the TetR tc binding pocket. Unlike the wildtype, the reverse TetR needs atc for tet operator binding, being no longer an inducer but a corepressor for this variant. In order to get more insights in the mechanism leading to activity reversal, in vivo and in vitro analyses were accomplished in this project. Albeit the mutated residues do not directly participate in atc binding, the affinities were strongly reduced compared to the wildtype and influence on Mg2+-independent atc binding could be detected. Thus, the mutations seem not only to alter TetR allostery, but also to interfere with signaltransduction or with corepressor binding. Nevertheless, tetO binding is strongly corepressor dependent, which is not due to reduced stability of the free proteins and stabilization of the structure by atc binding. Using engineered cysteins, the rate of disulfide bond formation upon ligand binding can be measured. The distance-increase upon tetO binding between residues in the DNA reading heads indicates similar conformational changes for the wildtype and revTetR, but the reverse variants need binding of atc for this movement. Analysis of the cysteins E107C and N165C´ revealed different cross-linking rates upon ligand binding. Thus, different conformational changes might occur in these proteins. To learn about the correlation between allostery and ligand binding the effect of mutations in the DNA reading head-core interface on the inducer specific TetRi2 (H64K S135L S138I) variant was analyzed. The same mutations can lead to completely different activities in the wildtype and TetRi2 mutant. Although neither L17 nor V99 participate in inducer binding, mutations of these residues result in altered 4-ddma recognition. Exchanges of one of these residues can lead to corepression by 4-ddma without altering DNA binding in the wildtype but 4-ddma-dependent repression in combination with reduced DNA binding in the absence of effector for TetRi2. Thus, mutations in this interface can influence DNA binding as well as inducer binding, albeit both ligand binding sites are not in direct contact to these altered residues. This finding represents a novel communication mode of TetR. Thus, allostery may not only operate by the structural change proposed on the basis of the crystal structures.

Abstract

Der Tet Repressor (TetR) reguliert die Expression von Tetrayclin-Resistenzdeterminanten auf Transkriptionsebene. Aufgrund der hohen Spezifität für den tet Operator und den Induktor Tetracyclin wird das Tet System in vielen Organismen zur Genregulation angewendet. Das Entfernen der 4-Dimethylaminogruppe vom Tetracyclin führt zum Verlust der Induktion von TetR. In dem ersten Projekt dieser Arbeit sollte die Induktorerkennung von TetR so verändert werden, dass nur noch 4-ddma, ein tc-Derivat dem die 4-Dimethylaminogruppe fehlt, zur Induktion führt, und die sehr potenten Induktoren Anhydrotetracyclin und Doxycyclin nicht mehr erkannt werden. Hierfür wurde versucht, im Wildtyp TetR und auf der Basis einer TetR Variante mit relaxierter Induktorspezifität, TetRi1 (H64K S135L), durch Einführen einer großen Aminosäure nahe der 4-Dimethylaminogruppe eine direkte sterische Hinderung für tc-Derivate mit dieser Funktion zu erzeugen. Von 43 untersuchten Mutanten konnte eine Variante mit dem erwünschten Phänotyp erhalten werden. Diese trägt die Mutationen H64K, S135L und S138I (TetRi2) und zeigt eine 440-fach bessere [4-ddma-Mg]+-Bindung im Vergleich zum Wildtyp, aber gleichzeitig eine 3 x 107-fach verschlechterte [atc-Mg]+-Bindung. Die Analyse der Auswirkungen der Mutation S138I in vivo und in vitro lassen vermuten, dass der Austausch zu einer direkten sterischen Interferenz mit der 4-Dimethylaminofunktion von tc, atc und dox führt, während bei Derivaten ohne diese Gruppe keine Beeinträchtigung zu erkennen ist. Außerdem weisen die Daten auf eine leicht veränderte Lage von 4-ddma in der Bindetasche hin. Im Gegensatz zum Wildtyp TetR benötigen reverse TetR Varianten atc um DNA binden zu können. Die in dieser Arbeit durchgeführten in vivo und in vitro Analysen sollten einen genaueren Einblick in den Mechanismus der Umkehrung der Allosterie eines Proteins geben. Es zeigte sich eine Beeinflussung der Korepressorbindung, obwohl die mutierten Aminosäuren nicht direkt an der Koordination beteiligt sind. Hierbei konnte auch eine Beeinflussung der atc-Bindung in Abwesenheit von divalenten Metallionen festgestellt werden, für die bereits ein alternativer Mechanismus postuliert wurde. Durch die Austausche wird anscheinend nicht nur die Allosterie des Proteins beeinflusst, sondern auch die Signalweiterleitung bei Korepressorbindung oder die Koordination des Korepressors verändert. Die Untersuchung der tet Operator-Bindung ergab eine deutliche Abhängigkeit der DNA-Bindung vom Korepressor atc, wobei dieser Effekt aber nicht durch eine geringere Stabilität der freien Proteine und eine Erhöhung der Stabilität bei Korepressorbindung bedingt ist. Die Analyse von Konformationsänderungen durch reversible Disulfidbrückenbildung zeigte eine offenbar gleiche Bewegung der DNA Bindeköpfe bei tetO-Bindung, wobei revTetR jedoch atc als Korepressor benötigt. Für die Cysteine E107C und N165C` ergaben sich unterschiedliche Disulfidbrückenbildungsraten bei atc-Bindung für den Wildtyp und revTetR. Es finden folglich unterschiedliche Bewegungen in den Proteinen statt. Um die Zusammenhänge zwischen Allosterie und Induktorerkennung zu untersuchen, wurden Mutationen in der Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNA-Bindekopf mit der induktorspezifischen Variante TetRi2 (H64K S135L S138I) kombiniert. Austausche in diesen Bereichen können völlig unterschiedliche Auswirkungen auf den Phänotyp haben, je nach dem, ob der Wildtyp oder TetRi2 betroffen ist. Obwohl die Aminosäuren an den Positionen 17 und 99 nicht direkt an der tc-Bindung beteiligt sind, zeigte sich ein deutlicher Einfluss auf die Erkennung von 4-ddma bei Mutation dieser Aminosäuren. Es konnte eine 4-ddma-vermittelte Korepression allein durch Mutationen von V99 oder L17 im Wildtyp festgestellt werden, während die atc-Induktion unverändert bleibt. Der gleiche Austausch kann die Allosterie von TetRi2 umkehren, ohne die Induktorerkennung zu beeinflussen. Mutationen die die Allosterie des Tet Repressors betreffen können folglich beides, die DNA-Bindung und die Induktorbindung beeinflussen. Somit konnte ein neuer Kommunikationsweg im Tet Repressor identifiziert werden, der aus den Kristallstrukturen nicht ersichtlich ist.

Citation
Henssler, E.M., et al., (2004) Structure Based Design of Tet Repressor to Optimize a New Inducer Specificity, Biochemistry 43 (29), 9512-9518; Henssler, E.M., et al., (2005) Tet repressor mutants with altered effector binding and allostery, Febs J 272: 4487-4496.
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