Methodology, Data Interpretation and Practical Transfer of Freeze-Dry Microscopy

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-04-01
Issue Year
2008
Authors
Meister, Eva
Editor
Abstract

For this thesis, methodology, data interpretation and practical transferability of results measured by freeze-dry microscopy were subject to detailed investigations. Previously published research work and findings were included in the discussion and in some cases were newly interpreted. Based on a theoretical background, experimental results led to a classification of collapse behavior in three collapse phases. For better theoretical and practical understanding and the explanation of recent and previous findings, a model of factors influencing freeze-dry microscopy experiments was developed in this thesis. During freeze-dry microscopy experiments the limiting parameter of the overall balance has to be the temperature or better the heating rate used. Pressure setting should be adequate, but not limiting. Besides temperature and pressure settings, the extent of supercooling, the physical properties of solved substances and their total solid content are primary factors of collapse events. To prove the introduced model, to investigate the importance of single parameters, and to find an optimized freeze-dry microscopy methodology, detailed studies were carried out including various experimental settings. For sucrose, trehalose, glucose, 2-(hydroxypropyl)-ß-cyclodextrin, and polyvinylpyrrolidone 10 and 40 kDa, a dependence of collapse temperatures on total solid content was found. Despite different extents and shapes of the plotted curves for the various excipients, three trends became obvious: (1) Within a given excipient class the collapse temperature increases with a higher molecular size or chain length (for polymers) and the difference between onset of collapse and full collapse decreases. (2) For all excipients an exponential correlation was investigated with low collapse temperatures for low concentrations and higher collapse temperatures for intermediate concentrations (10 to 15% w/w). (3) Hygroscopic substances show a decrease of collapse temperature values for high (about 20 to 30% w/w) total solid contents (depending on the excipient). Furthermore, it was found that bovine serum albumin and human serum albumin are interchangeable from freeze-dry microscopy measurements based on their structural similarity. In contrast to glass transition temperature Tg´, their collapse temperatures were clearly and relatively easily detectable by freeze-dry microscopy. Studies on binary mixtures of protein with a disaccharide revealed a high dependence of collapse temperatures (onset and full collapse) on the composition of the mixture. Differences in freeze-drying and collapse behavior were strong as well. For selected excipients and binary mixtures of protein and disaccharide the measured collapse temperatures were compared to glass transition temperatures of the maximally freeze-concentrated solutions. Due to the dependence of the collapse temperature on total solid content of the measured substance(s), differences between collapse temperatures and glass transition temperatures varied strongly for excipient solutions as well as protein/sugar mixtures. By freeze-dry microscopy measurements in combination with lab-scale freeze-drying runs it could be shown that obtained collapse temperature results are in general transferable to freeze-drying cycles with regard to, e.g., the difference detected for collapse temperature between different concentrations of the same excipient. Scanning electron microscopy in combination with BET specific surface area measurements clearly indicated severe damages in cakes for which primary drying was performed at higher product temperatures, even it was performed below the temperature of the onset of collapse.

Abstract

Thema der vorliegenden Dissertation waren detaillierte Untersuchungen zu Methodik, Dateninterpretation und praktischer Übertragbarkeit von gefriertrocknungsmikroskopischen Messungen. Früher publizierte Arbeiten und Befunde wurden in die Diskussion integriert und in einigen Fällen neu interpretiert. Basierend auf theoretischen Überlegungen und praktischen Erfahrungen wurde das Kollapsverhalten in drei verschiedene Kollapsphasen klassifiziert. Um zu einem besseren theoretischen und praktischen Verständnis des Phänomens „Kollaps“ beizutragen und um Ergebnisse jüngeren und älteren Datums (besser) zu erklären, wurde im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ein Model aufgestellt, das die Faktoren, welche gefriertrocknungsmikroskopische Experimente beeinflussen, im Kontext darstellt. Während eines gefriertrocknungsmikroskopischen Experiments sollte der limitierende Faktor im Gesamtgleichgewicht auf Seiten der Temperatur oder - besser gesagt - der verwendeten Heizrate liegen. Die gewählten Druckeinstellungen sollten adäquat, aber nicht limitierend sein. Neben den Temperatur- und Druckbedingungen nehmen der Grad der Unterkühlung, die physikalischen Eigenschaften der gelösten Substanzen sowie ihre jeweiligen Konzentrationen primär Einfluss auf das Kollapsgeschehen. Um das eingeführte Modell zu untermauern, die Wichtigkeit der einzelnen Parameter zu untersuchen und eine optimierte Methodik für die Gefriertrocknungsmikroskopie zu finden, wurden detaillierte Studien durchgeführt, insbesondere zu den experimentellen Einstellungsmöglichkeiten. Für Saccharose, Trehalose, Glucose, 2-(Hydroxypropyl)-ß-cyclodextrin sowie Polyvinylpyrrolidon 10 kDa und 40 kDa wurde eine Abhängigkeit der Kollapstemperatur vom Feststoffgehalt der Lösung festgestellt. Trotz der Unterschiede im Grad der Beeinflussung und trotz verschiedener Kurvenverläufe für die unterschiedlichen Hilfsstoffe, kristallisierten sich folgende tendenzielle Zusammenhänge heraus: (1) Für eine bestimmte Hilfsstoffklasse nimmt die Kollapstemperatur mit zunehmender Molekülgröße oder Kettenlänge (für Polymere) zu und die Differenz zwischen beginnendem und vollständigem Kollaps wird kleiner. (2) Für alle Hilfsstoffe wurde eine exponentielle Korrelation zwischen Konzentration und Kollapstemperatur ermittelt, wobei die Kollapstemperaturen für niedrige Konzentrationen niedrig und für mittlere Konzentrationen (10 bis 15% m/m) hoch waren. (3) Für hohe Feststoffkonzentrationen (ca. 20 bis 30% m/m) zeigen hygroskopische Substanzen eine Erniedrigung der Kollapstemperatur, deren Betrag je nach Hilfsstoff variiert. Außerdem wurde gezeigt, dass bovines Serumalbumin und humanes Serumalbumin, was gefriertrocknungsmikroskopische Messungen betrifft, aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit austauschbar sind. Im Gegensatz zur Glasübergangstemperatur Tg´ konnte ihre Kollapstemperatur eindeutig und relativ leicht per Gefriertrocknungsmikroskopie festgestellt werden. Versuche mit binären Mischungen eines Proteins mit einem Disaccharid förderten eine hohe Abhängigkeit der Kollapstemperatur (des beginnenden und vollständigen Kollapses) von der Mischungszusammensetzung zu Tage. Große Unterschiede wurden auch beim Gefriertrocknungs- und Kollapsverhalten festgestellt. Für ausgewählte Hilfsstoffe und binäre Mischungen mit Protein und Disacchariden wurden die gemessenen Kollapstemperaturen mit der Glasübergangstemperatur der maximal aufkonzentrierten Lösung verglichen. Aufgrund der Abhängigkeit der Kollapstemperatur von der Feststoffkonzentration der gemessenen Substanz(en), variierten die Differenzen zwischen der Kollapstemperatur und der Glasübergangstemperatur stark für die Hilfsstofflösungen und die Protein/Zucker-Mischungen. Durch gefriertrocknungsmikroskopische Messungen in Kombination mit Gefriertrocknungsläufen in einer Laboranlage konnte gezeigt werden, dass die erhaltenen Kollapstemperaturergebnisse im Allgemeinen auf Gefriertrocknungszyklen übertragbar sind, was zum Beispiel die Unterschiede in der Kollapstemperatur zwischen verschiedenen Konzentrationen eines einzelnen Hilfsstoffes betrifft. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen kombiniert mit BET-Messungen der spezifischen Oberfläche wiesen eindeutig darauf hin, dass Kuchen Schäden aufwiesen, wenn sie bei höheren Produkttemperaturen während der Primärtrocknung getrocknet wurden, auch wenn diese Temperaturen unterhalb der Temperatur des beginnenden Kollapses lagen.

DOI
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