Entwicklung eines Anlagenkonzeptes zur Proliferation von primären, antigen-spezifischen T-Zellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2006-09-04
Issue Year
2006
Authors
Meier, Stephan Michael
Editor
Abstract

A reactor system employing an Immobilisate strategy was developed to facilitate the rapid generation of autologous T-cell transplants. The reactor system was centred by a ~ 5 ml-scale fluidised bed reactor, which was thereon characterised concerning its mass transfer and hydrodynamic behaviour. The diffusional characteristics of the employed immobilisates was analysed also in the run-up to the later cultivations. All cultures were immobilised in microcapsules made up from Sodiumcellulosesulphate / Polydiallyledimethyleammoniachloride of ~ 500 µm in diameter and cultured for a period of 14 days. Jurkat-T-Cells, CD3+-sorted, primary T-Cells and Adenovirus-specific (AdV+), primary T-Cells with irradiated feeder-layer were cultured. It could be shown that all upper cell types can be expanded successfully in the aforementioned system. The Jurkat-T-cell line could be expanded from 5x10^6ml^-1 to 1,1x10^8ml^-1. For the CD3+-culture an expansion from 4,8x10^6ml^-1 to 4,2x10^7ml^-1 could be derived, while antigen-specific T-Cells could be proliferated from 5x10^4ml^-1 to 4,7x10^6ml^-1. Besides from the two-day interval measurement of the cell count via a Resazurin-Assay, process parameters such as Glucose, Lactate, pO2 and concentrations of the cytokines IL-2, IL-4, IFN-g and TGF-b were monitored continuously and daily respectively. After any cultivation of primary cells a flow-cytometric measurement was done, to make a statement on the differentiation behaviour of the cultivated cells. Within these data no significant deviations could be found. The measurements of cytokine concentration correlated well with the results derived from the Resazurin-Assay method and the flow-cytometric analyses.

Abstract

Zur Erzeugung autologer T-Zell-Transplantate wurde ein Reaktorsystem unter Verwendung einer Immobilisatstrategie entwickelt. Bei dem entwickelten Reaktorsystem handelt es sich um eine Wirbelschicht im ~ 5 Millilitermaßstab, die in ihrem hydrodynamischen und Stoffaustauschverhalten charakterisiert wurde. Die Diffusionseigenschaften der verwendeten Immobilisate wurden ebenfalls im Vorfeld der Kultivierungen untersucht. Alle Kulturen wurden in ~ 500µm durchmessenden Mikrohohlkugeln aus Natrium-Cellulosesulfat / Polydiallyldimethylammoniumchorid immobilisiert und hierin für 14 Tage kultiviert. Kultiviert wurden Jurkat-T-Zellen, CD3+-sortierte, primäre T-Zellen und Adenovirus-spezifische (AdV+), primäre T-Zellen mit bestrahltem Feeder-Layer. Es konnte gezeigt werden, dass alle oben angegebenen Zelltypen erfolgreich expandiert werden können. Hierbei wurde für die Jurkat-T-Zelllinie eine Expansion von 5x10^6ml^-1 auf 1,1x10^8ml^-1 ermittelt; Für die CD3+-Kultur ergab sich eine Expansion von 4,8x10^6ml^-1 auf 4,2x10^7ml^-1, während die Population der antigenspezifischen T-Zellen von 5x10^4ml^-1 auf 4,7x10^6ml^-1 proliferiert werden konnte. Neben der zweitägigen Aufnahme der Zellzahlverläufe über ein Resazurin-Assay wurden simultan die Prozessparameter Glukose, Laktat, Sauerstoffpartialdruck und die Konzentration der Zytokine IL-2, IL-4, IFN-g und TGF-b kontinuierlich bzw. täglich quantifiziert. Nach jeder Kultivierung von primären Zellen wurde zusätzlich eine durchflusszytometrische Analyse der Zellen durchgeführt, um zusammen mit den gemessenen Zytokinkonzentrationen eine Aussage über das Differenzierungsverhalten im Kultursystem zu erlauben. Hier wurden keine signifikanten Abweichungen gefunden. Die Daten der Zytokinmessungen korrelierten gut mit den Ergebnissen aus den Resazurinmessungen, ebenso mit den durchgeführten durchflusszytometrischen Messungen.

DOI
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