In-vitro analysis of the induction of glaucomatous changes by TGF-ß2 and other aqueous humor components in cultivated human astrocytes of the N. opticus

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-07-23
Issue Year
2010
Authors
Neumann, Carolin
Editor
Abstract

Glaucoma in general is defined as a progressive degeneration of optic nerve axons and retinal ganglion cells. In POAG, these degenerative processes are frequently accompanied by an evident increase of the extracellular matrix (ECM) within the aqueous humor (AH) outflow tissues in the anterior chamber as well as within the optic nerve. In the prelaminar region, elastotic changes are most prevalent, i.e. there is an overproduction of elastic fibers that are deposited in a disorganized manner. In the laminar and postlaminar region in contrast, increased deposits of collagenous material are predominant, especially type I, III, IV and VI. In the past, it has been shown by several studies that TGF-ß2, an AH factor being significantly increased in approximately 50% of the POAG cases, elevates the expression and synthesis of glaucoma associated ECM components by human astrocytes in vitro in a connective tissue factor (CTGF) dependent manner. In the first part of this thesis, it was shown that type VI collagen and elastin were responsive to TGF-ß2 in cultured human astrocytes. In line with previous findings it was demonstrated by CTGF silencing experiments that the determined activations of type VI collagen and elastin were also CTGF dependent. By these experiments, also the hypothesis that type 1B astrocytes of the prelaminar compartment and type 1A astrocytes of the postlaminar compartment respond differentially to TGF-ß2, resulting in the observed different types of connective tissues reactions in both regions, was tested. However, both types of astrocytes, cultivated separately and characterized by immunofluorescence stainings, responded identically to TGF-ß2 treatment, at least in respect of ColVI subchain and elastin expression. In the second part of the thesis, the effects of TGF-ß2 treatment on the expression of components of the ECM degradation system in cultured human astrocytes were analyzed. Here it was demonstrated that TGF-ß2 had no effect on the expression of the analyzed Matrix metalloproteinases. Solely MMP-2 expression was mildly increased. Tissue inhibitors of MMP activity TIMP-1 and -3 were increased. The strongest effect was observed for Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), whereas tissue plasminogen activator tPA was repressed. By gelatin zymography, an actual repressive effect of the TGF-ß2 treatment on MMP activation was demonstrated. Further it was shown that the TGF-ß2 mediated regulatory effects on MMP-2 and PAI-1 expression were not CTGF dependent. In the last part of the thesis, seven novel putative TGF-ß2 responsive candidates were identified in cultured human astrocytes by use of an Oligo GEArray® ‘Extracellular Matrix and Adhesion Molecules. By subsequent experiments only the responsiveness of Osteopontin (OPN) was confirmed. In order to test if astrocytes are able to respond to OPN themselves, expression of the most prevalent OPN receptors on astrocytes was tested by PCR and immunofluorescence staining. Astrocytes were positive for CD44 and the ubiquitary integrin subunits. TGF-ß2 had no regulatory effect on their expression. ELISA analysis of human AH samples from controls and POAG patients identified OPN as a novel AH component. In the controls, a mean average concentration of 253ng/ml was determined, and in the POAG samples (261ng/ml). The variation of the individual samples was significantly higher in the PAOG samples (41ng/ml - 1027ng/ml), than in the controls (139ng/ml - 434ng/ml). Based on these findings, from then on control astrocytes were propagated in the presence of 250ng/ml OPN to mimic the in vivo situation. Experiments were conducted analyzing regulatory effects of OPN depletion (0ng/ml) as well as treatment with higher OPN concentrations (1000 and 2000ng/ml) on the expression of ECM components, components of the ECM degradation system and POAG associated stress proteins. There we found that depletion of OPN had no regulatory effect on any of the tested candidates. The same applied for CTGF and PAI-1 when astrocytes were treated with 1000 and 2000ng/ml OPN, respectively. In addition to that, the effect of the different OPN concentrations on the proliferation of cultured human astrocytes and the rat retinal ganglion cell line RGC5 was tested. Depletion of OPN led to a significant reduction of astrocytes’ and RGC5’ activity compared to the controls (250ng/ml). The same applied for cells cultivated in presence of 2000ng/ml OPN. In contrast to that cells cultivated in presence of 1000ng/ml OPN displayed a significantly increased metabolic activity. Additionally, by blocking experiments it was demonstrated that OPN signaling via CD44 conducts an anti-proliferative signal whereas signaling via integrin receptors conducts a proliferative signal in astrocytes.

Abstract

Glaukomerkrankungen sind definiert durch eine progressive Degeneration der Axone des Sehnervs und dem Untergang retinaler Ganglienzellen. Beim primären Offenwinkelglaukom (POWG) werden diese degenerativen Prozesse häufig von einer deutlichen Vermehrung von extrazellulärer Matrix (EZM) in den Kammerwasserabflussgeweben des vorderen Auges sowie im Sehnerv begleitet. Am Rande der prälaminären Region des Sehnervenkopfes kommt es zu einer Vermehrung von elastischer Fasern, die ungeordnet abgelagert werden. Im Gegensatz dazu überwiegen in der laminären und postlaminären Region vermehrte Ablagerungen von kollagenem Material, vor allem von Kollagen Typ I, III, IV und VI. In der Vergangenheit wurde in verschiedenen in vitro Studien gezeigt, dass TGF-ß2, ein Kammerwasserfaktor der in ungefähr 50% der POWG erhöht ist, sowohl die Expression als auch die Synthese von glaukomassoziierten EZM Komponenten in Abhängigkeit von connective tissue factor (CTGF) in kultivierten menschlichen Sehnervastrozyten steigert. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Typ VI Kollagen und Elastin in kultivierten menschlichen Sehnervastrozyten durch TGF-ß2 Behandlung vermehrt exprimiert werden. Durch CTGF silencing Experimente konnte gezeigt werden, dass die Aktivierungen von Typ VI Kollagen und Elastin ebenfalls CTGF abhängig sind. In diesen Experimenten wurde auch die Hypothese überprüft, ob Typ 1B Astrozyten der prälaminären Region und Typ 1A Astrozyten der postlaminären Region unterschiedlich auf TGF-ß2 reagieren. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Astrozytentypen, getrennt kultiviert und durch Immunfluoreszenzfärbungen spezifisch charakterisiert, zumindest bezüglich der Expression von Typ VI Kollagen und Elastin, gleich auf die Behandlung mit TGF-ß2 reagierten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt von TGF-ß2 auf die Expression verschiedener Komponenten des EZM Abbausystems in kultivierten menschlichen Astrozyten untersucht. Es wurde gezeigt, dass TGF-ß2 keinen Effekt auf die Expression der untersuchten Matrix Metalloproteinasen hat. Lediglich die Expression von MMP-2 wurde leicht erhöht. Inhibitoren der MMP Aktivität TIMP-1 und TIMP-3 waren erhöht. Besonders stark war die Expression des Plasminogen Aktivator Inhibitor-1 (PAI-1) induziert. Tissue plasminogen activator (tPA) war reduziert. Durch Zymographie wurde eine tatsächliche Reduzierung der MMP-2 Aktivierung, als Folge der TGF-ß2 Behandlung, gezeigt. Die TGF-ß2 vermittelten regulatorischen Effekte auf die MMP-2 und PAI-1 Expression waren nicht CTGF abhängig. Im letzten Teil der Arbeit wurden in kultivierten menschlichen Astrozyten des Sehnervs durch einen Oligo GEArray® ‘Extracellular Matrix and Adhesion Molecules’ sieben neue potentiell TGF-ß2 responsive Kandidaten identifiziert. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings nur die Responsivität von Osteopontin (OPN) bestätigt. Um zu überprüfen, ob Astrozyzten selbst durch OPN stimuliert werden können, wurde durch PCR und Immunfluoreszenzfärbungen die Expression der gängigsten OPN Rezeptoren auf kultivierten Astrozyten untersucht. Astrozyten exprimierten CD44 und die ubiquitären Integrin Untereinheiten. TGF-ß2 hatte auf ihre Expression keinen Einfluss. ELISA Analysen von Kammerwasserproben aus menschlichen Kontrollaugen und POWG-Augen identifizierten OPN als neuen Kammerwasserfaktor. In den Kontrollen wurde eine Durchschnittskonzentration von 253ng/ml ermittelt, in den POWG Proben 261ng/ml. Die Schwankung der Einzelwerte war in den POWG Proben deutlich größer (41ng/ml - 1027ng/ml) als in den Kontrollen (139ng/ml - 434ng/ml). Deshalb wurden Astrozyten, die als Kontrollen dienten, ab diesem Zeitpunkt mit 250ng/ml OPN kultiviert. Es wurden Experimente durchgeführt um eventuelle regulatorische Effekte von OPN Entzug (0ng/ml) und höherer OPN Konzentrationen (1000 und 2000ng/ml) auf die Expression von ECM Komponenten, Komponenten des ECM Abbausystems sowie POWG assoziierter Stressproteine zu ermitteln. Dabei zeigte sich, dass OPN Entzug keine regulatorischen Effekte auf alle untersuchten Kandidaten hatte. Behandlung mit 1000 oder 2000ng/ml OPN hatte ebenfalls keinen Einfluss auf CTGF und PAI-1. Zusätzlich wurde der Effekt der verschiedenen OPN Konzentrationen auf die Proliferation kultivierter Sehnervenastrozyten sowie der retinalen Ganglienzellen RGC5 untersucht. OPN Entzug induzierte eine signifikante Abnahme der Astrozyten- und RGC5-aktivität im Vergleich zu den Kontrollen (250ng/ml). Das Gleiche traf auf Zellen zu, die mit 2000ng/ml OPN behandelt wurden. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit 1000ng/ml kultiviert wurden eine signifikant gesteigerte metabolische Aktivität. Rezeptor-Blockierungsexperimente zeigten, dass ein über CD44 transduziertes OPN signaling einen anti-proliferativen Effekt hat, wohingegen ein Integrin transduziertes signaling einen proliferativen Effekt auf humane Sehnervenastrozyten hat.

DOI
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