The Regulation of PD-L1 Secretion in Extracellular Vesicles by Melanoma Cells

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Granting Institution
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Medizinische Fakultät
Issue Date
2023
Authors
Liu, Jie
Editor
Abstract

Tumor cells evade immune surveillance by upregulating surface expression of PD-L1, which interacts with PD-1 on T cells to elicit an immune checkpoint response. Anti-PD-1/PD-L1 antibodies have shown remarkable promise in treating tumors, including metastatic melanoma. However, patient response rate is limited. Tumor cells have been shown to secrete extracellular vesicles (EVs) that express PD-L1 on their surface, leading to increased immunosuppression and impaired response to anti-PD-L1 immunotherapy. However, the molecular mechanisms leading to secretion of PD-L1 in EVs by melanoma cells remain unclear. Hence, a better understanding of PD-L1-EV secretion by melanoma cells is needed as well as an analysis of the target effects of these vesicles. There is evidence that only a cleaved/mature PD-L1 protein is secreted in vesicles, whereas its intracellular part remains in endosomes of the host cell. In this study, it was observed that overexpressing a PD-L1 reporter protein (GFP-PD-L1-RFP) in melanoma cells resulted in proteolytic processing of the construct and caused significant cytotoxicity. Therefore, in order to study PD-L1 processing and secretion in melanoma cells, I designed an inducible system using a mutant estrogen receptor in conjunction with the PD-L1 reporter protein (GFP-PD-L1-RFP-mER). I confirmed that, without induction, this fusion construct was expressed but not proteolytically processed in SK-MEL-37 melanoma cells, thus preventing cytotoxicity. This construct enabled me to generate a stable cell line for further deciphering the PD-L1 processing and secretion pathway in melanoma. In parallel, studies with melanoma patient plasma-derived EV (pEV) samples revealed that PD-L1 levels positively correlated with ADAM10 protease activity in pEV. Furthermore, they were significantly elevated in advanced stage melanoma. Hence, PD-L1 levels in pEV might serve as a future biomarker for predicting disease progression in the course of melanoma. Taken together, these works demonstrate that PD-L1 secretion via EV by melanoma cells may have a high pathological relevance and could potentially serve as a biomarker for distinguishing clinical stages and assess progression of the disease.

Abstract

Tumorzellen entziehen sich der Immunüberwachung, indem sie die Oberflächenexpression von PD-L1 hochregulieren, das mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um eine Immun-Checkpoint-Reaktion auszulösen. Anti-PD-1/PD-L1-Antikörper haben sich bei der Behandlung von Tumoren, einschließlich des metastasierenden Melanoms, als vielversprechend erwiesen. Die Ansprechrate der Patienten ist jedoch begrenzt. Es hat sich gezeigt, dass Tumorzellen extrazelluläre Vesikel (EVs) absondern, die PD-L1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, was zu einer verstärkten Immunsuppression und einem schlechteren Ansprechen auf die Anti-PD-L1-Immuntherapie führt. Die molekularen Mechanismen, die zur Sekretion von PD-L1 in EVs durch Melanomzellen führen, sind jedoch noch unklar. Daher ist ein besseres Verständnis der PD-L1-EV-Sekretion durch Melanomzellen ebenso erforderlich wie eine Analyse der Zielwirkungen dieser Vesikel. Es gibt Hinweise darauf, dass nur ein gespaltenes/reifes PD-L1-Protein in Vesikel sezerniert wird, während sein intrazellulärer Teil in den Endosomen der Wirtszelle verbleibt. In dieser Studie wurde beobachtet, dass die Überexpression eines PD-L1-Reporterproteins (GFP-PD-L1-RFP) in Melanomzellen zu einer proteolytischen Verarbeitung des Konstrukts führte und eine erhebliche Zytotoxizität verursachte. Um die Verarbeitung und Sekretion von PD-L1 in Melanomzellen zu untersuchen, habe ich daher ein induzierbares System entwickelt, das einen mutierten Östrogenrezeptor in Verbindung mit dem PD-L1-Reporterprotein (GFP-PD-L1-RFP-mER) verwendet. Ich bestätigte, dass dieses Fusionskonstrukt ohne Induktion in SK-MEL-37-Melanomzellen zwar exprimiert, aber nicht proteolytisch prozessiert wurde, wodurch die Zytotoxizität verhindert wurde. Mit diesem Konstrukt konnte ich eine stabile Zelllinie erzeugen, um den PD-L1-Prozessierungs- und Sekretionsweg im Melanom weiter zu entschlüsseln. Parallel dazu ergaben Studien mit aus Plasma gewonnenen EV-Proben (pEV) von Melanompatienten, dass die PD-L1-Werte positiv mit der ADAM10-Proteaseaktivität in pEV korrelierten. Außerdem waren sie bei Melanomen im fortgeschrittenen Stadium deutlich erhöht. Der PD-L1-Gehalt in pEV könnte daher künftig als Biomarker für die Vorhersage des Krankheitsverlaufs beim Melanom dienen. Insgesamt zeigen diese Arbeiten, dass die Sekretion von PD-L1 über EV durch Melanomzellen eine hohe pathologische Relevanz haben kann und möglicherweise als Biomarker für die Unterscheidung klinischer Stadien und die Bewertung des Fortschreitens der Krankheit dienen könnte.

DOI
URN
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