Interaktionen von Lymphendothelzellen und mesenchymalen Stammzellen in vitro

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2016-12-19
Issue Year
2016
Authors
Pfuhlmann, Romy
Editor
Abstract

The formation of distant metastasis is the main cause of morbidity and mortality for patients with cancer. Cancer cells can disseminate from the primary site via hematogenous and lymphatic routes, which is the main obstacle for the development of effective cancer therapies. Although surgical and radio therapy are able to control many primary tumors, the occurrence of metastasis still means a bad prognosis for the patients. A better understanding of the underlying mechanisms of metastasis could help to develop more effective therapies. In the future, an approach for prevention or reduction of lymphatic metastasis could aim the lymphatic vessels themselves. However, little is known so far about development, function and molecular mechanisms of lymphangiogenesis. Therefore the aim of the present study was the evaluation of the in vitro interactions of human mesenchymal stem cells and lymphatic endothelial cells, which is the basis for ongoing experiments to understand the formation of lymphatic vessels in pathological diseases as well as the lymphatic metastasis more detailed. MSC are an interesting candidate for studying these processes, because there is already evidence from blood- angiogenesis that MSC and blood endothelial cells interact with each other and thus contribute to neoangiogenesis. In the first part of the study, the interactions of MSC and LEC by cytokines or cell-cell contacts were analyzed by in vitro angiogenesis assays. Processes of lymphangiogenesis like proliferation, migration, transmigration and sprouting were examined by adding the known pro(lymph)angiogenic growth factors VEGF-C, bFGF, HGF or MSC conditioned medium to the cells or by combination of the two cell types. Furthermore, the contribution of MSC to the formation of new vessels by forming tubular structures (tube formation) in vitro was analyzed. In the second part of the study the results of the growth factor experiments were validated by adding specific neutralizing antibodies to the single growth factors or the MSC CM. However, their influence on lymphatic endothelial cells is largely unexplored. Lymphangiogenic processes like proliferation, migration, transmigration and tube formation could be potently enhanced both by the single growth factors VEGF-C, bFGF, HGF and MSC secreted factors. This stimulative effect was confirmed by addition of specific neutralizing antibodies inhibiting the lymphangiogenic response. It became clear that the examined factors are involved differently in the individual processes of lymphangiogenesis. Stimulation of LEC with the single growth factors in basal medium in combination with the corresponding antibodies elucidated that VEGF-C as well as bFGF and HGF directly act on lymphangiogenesis, because the lymphatic response of LEC was completely silenced afterwards. Addition of the antibodies to MSC CM showed that only VEGF-C and its receptor VEGFR-3 are essential for all of the examined processes (proliferation, migration, transmigration, tube formation). There is also an essential role of bFGF and HGF for proliferation and tube formation but not for the migratory behavior of LEC. To clarify the exact roles of the different growth factors further experiments, also with alternative factors, as well as a detailed analysis of the composition of the MSC CM are necessary. In contrast to the processes of proliferation, migration and tube formation the present results have shown that stimulation of LEC sprouting was not as much as expected both in fibrin and collagen gels. This study presents for the first time the positive influence of conditioned medium of primary human MSC on the lymphangiogenic response of primary human LEC. The results from the in vitro experiments are the basis for the following in vivo establishment of a lymphatic vessel network. Understanding the mechanisms of lymphangiogenesis and the role of growth factors involved could help to get deeper insights into the mechanisms of lymphangiogenesis in pathological processes as well as lymphatic metastasis. Stimulation with growth factors and modification by the use of transfected LEC serve to further investigate manipulation of the lymphangiogenic cascade with the aim to validate novel therapeutic strategies.

Abstract

Neben der Metastasierung über das Blutgefäßsystem metastasieren maligne Tumore in andere Organe über die Lymphgefäße. Dies wird als die Haupttodesursache bei Krebspatienten und als größtes Hindernis bei der Entwicklung effektiver Krebstherapien angesehen. Obwohl die chirurgische Therapie und Radiotherapie heute in der Lage ist, viele Primärtumoren zu kontrollieren, bedeutet das Auftreten von Metastasen immer noch eine schlechte Prognose. Ein besseres Verständnis über die Mechanismen der Metastasierung könnte helfen, effektivere Therapien zu entwickeln. Ein Ansatz zur Verhinderung oder Reduktion der lymphogenen Metastasierung könnte zukünftig auf die Lymphgefäße selbst zielen. Allerdings ist bisher nur wenig über die Entwicklung, Funktion und die molekularen Mechanismen der Lymphangiogenese bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von humanen mesenchymalen Stammzellen und Lymphgefäßendothelzellen näher zu untersuchen, um später die Neubildung von Lymphgefäßen in pathologischen Vorgängen sowie die lymphogene Metastasierung besser verstehen zu können. MSC stellen dabei einen interessanten Kandidaten für die Untersuchung dieser Prozesse dar, da es bereits Hinweise aus der Blutangiogenese gibt, dass MSC und Blutendothelzellen miteinander interagieren und so zur Neoangiogenese beitragen. Ihr Einfluss auf Lymphendothelzellen ist jedoch weitestgehend unerforscht. Es wurden zunächst die Interaktionen von MSC und Lymphgefäßendothelzellen über Zytokine oder Zell-Zellkontakte mittels klassischer in vitro Angiogeneseversuche analysiert. Durch Zugabe der bekannten pro-(lymph)angiogenen Wachstumsfaktoren VEGF-C, bFGF und HGF bzw. MSC konditioniertem Medium oder dem Zusammenführen der beiden Zellpopulationen wurden Komponenten der Lymphangiogenese wie Proliferation, Migration, Transmigration und Sprossung untersucht. Des Weiteren wurde die Beteiligung bzw. der Einbau der MSC am Gefäßaufbau durch das Bilden röhrenförmiger Strukturen in vitro genauer betrachtet. In einem weiteren Versuchsabschnitt wurden die Ergebnisse der Wachstumsfaktorversuche mit spezifischen, neutralisierenden Antikörpern gegen die Wachstumsfaktoren überprüft. Mit Hilfe der durchgeführten Wachstumsfaktor- und Antikörperversuche konnte gezeigt werden, dass sowohl die einzeln zugegebenen Wachstumsfaktoren VEGF-C, bFGF und HGF als auch die durch MSC sekretierten Faktoren im MSC CM eine stimulierende Wirkung auf die Prozesse der Proliferation, Migration, Transmigration und Bildung röhrenförmiger Strukturen haben. Dies konnte zudem durch die Zugabe spezifischer, neutralisierender Antikörper bestätigt werden, da es hier zu einer Hemmung der stimulierenden Wirkung kam. Dabei wurde deutlich, dass die untersuchten Faktoren unterschiedlich an den einzelnen Prozessen der Lymphangiogenese beteiligt sind. So konnte zunächst nach Zugabe der einzelnen Faktoren festgestellt werden, dass VEGF-C, bFGF und HGF direkt auf die Lymphangiogenese wirken, da eine Neutralisierung durch die entsprechenden Antikörper eine lymphangiogene Antwort der LEC unterdrückte. Die Ergebnisse nach Zugabe der Antikörper zum MSC CM zeigten jedoch, dass nur VEGF-C und sein Rezeptor VEGFR-3 essentiell für alle untersuchten Prozesse (Proliferation, Migration, Transmigration, Bildung röhrenförmiger Strukturen) sind, da deren Wirkung nicht durch andere, im MSC CM enthaltene Faktoren kompensiert werden konnte. Für bFGF und HGF konnte ebenfalls eine essentielle Rolle für die Proliferation und Bildung röhrenförmiger Strukturen durch die LEC nachgewiesen werden, nicht jedoch für das migratorische Verhalten der Zellen. Um den Einfluss dieser Faktoren genauer aufzuklären, sind weitere Versuche, unter anderem auch mit alternativen pro-lymphangiogenen Faktoren, notwendig. Hierfür ist eine detailierte Analyse der Zusammensetzung des MSC CM unumgänglich. Im Gegensatz zu den Prozessen der Proliferation, Migration und der Bildung röhrenförmiger Strukturen, welche durch MSC sekretierte Faktoren deutlich stimuliert werden konnten, war ein derartiger Effekt für die Sprossung der LEC Sphäroide sowohl nach Einbettung in Kollagen- als auch Fibringele nicht zu beobachten. Mit der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine pro-lymphangiogene Wirkung von humanen MSC auf humane LEC nachgewiesen werden. Dies schafft die Grundlage für die Etablierung eines Lymphgefäßnetzwerkes in vivo, mit Hilfe dessen die Neubildung von Lymphgefäßen in pathologischen Vorgängen wie z. B. Tumorleiden sowie die lymphangiogene Metastasierung genauer untersucht werden kann. Diese Erkenntnisse können dann für eine möglicherweise therapeutische Hemmung der Lymphgefäßnetzwerkbildung und somit vermindertes Tumorwachstum und Metastasierung genutzt werden.

DOI
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