Effekte von Levetiracetam auf neurotrophe Hypoxie-induzierbare Faktoren im unreifen Gehirn der Maus unter akuter systemischer Hypoxie

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-11-10
Issue Year
2010
Authors
Schneider, Julia
Editor
Abstract

Background and objectives: Perinatal hypoxia is one of the most important causes for hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). The extention and the prognose of the cerebral damage depend on the gestational age of the newborn and therefore on the cerebral maturation. Perinatal hypoxia also activates endogeneous cascades of protection. The keyregulator of these processes is the hypoxia-inducible factor (HIF). As a factor of transcription HIF regulates the expression of several genes limiting the toxic effects of hypoxia. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and the inducible NO-synthetase (iNOS) are parts of these genes. Both are involved in the regulation of the vessels following hypoxic conditions. A further role in the cascade of neuronal damage caused by perinatal hypoxia plays the enzyme csapase-3 which initiates apoptotic mechanisms. Actually there exists no specific neuroprotective therapy to treat the HIE. Levetiracetam (LEV) is an antiepileptic drug of the newer generation that showed neuroprotective attributes in experiments with animals. In the literature are no data available of the effects of LEV on neurotrophic and vasoactive HIF-regulated factors under hypoxic conditions in the premature brain. The objective of the present study was to characterize cerebral vasoactive and neurotrophic HIF-regulated mechanisms following acute systemic hypoxia in the extreme premature brain. Another objective was to analyse the influence of LEV on neurotrophic and vasoactive factors induced by hypoxia. Methods: Following expressions of genes were examined by RT-PCR: 1) the cerebral mRNA-expression of the HIF-dependend genes VEGF and iNOS and of the hypoxia-induced but not HIF-dependend genes nNOS, eNOS and caspase-3 under hypoxic conditions (8% O2 for 6 hours) 2) the influence of LEV on the expression of these genes under hypoxic and normoxic conditions. The experiments were carried out in two different development states of the premature brain of the neonatal mouse at P0 and P7. The data were statistically and graphically analysed by GraphPad PRISM version 4.0 Software. Results and observations: Acute hypoxia led to a significant increase of the mRNA-expression of VEGF and to a significant decrease of the mRNA-expression of iNOS at P0 and P7. In the opposite of this there was no significant change of the mean mRNA-concentrations of nNOS, eNOS and caspase-3 under hypoxia neither at P0 nor at P7. After a treatment with LEV no significant changes of the expression of the HIF-regulated factors VEGF and iNOS could be detected in normoxia at P0 and P7. Under hypoxia the expression of the VEGF-mRNA increased significantly in the brain of the LEV-treated animals at P0 and P7. The mRNA-expression of iNOS decreased significantly after a treatment with LEV in hypoxia at P7. In contrast to this, no significant decrease of the expression of iNOS-mRNA in hypoxia could be shown at P0. The mean concentrations of the mRNA of nNOS, eNOS and caspase-3 were not changed significantly after a treatment with LEV in normoxia and hypoxia neither at P0 nor at P7. Practical conclusion: In conclusion it could be detected a significant change of the mRNA-expression of the HIF-depended factors in acute hypoxia at P0 and P7 which is in consense with the thesis that HIF plays a keyrole in the regulation of cerebral hypoxia in the premature brain. Furthermore, the present study showed no obvious influence of LEV on the expression of HIF-dependend and HIF-undependend but hypoxia-inducable genes. This implies that LEV has no significant effect on the endogenous mechanisms of protection in the premature brain neither in normoxia nor in hypoxia. To ensure a possible neuroprotective effect of LEV in hypoxia in the premature brain further studies are planned.

Abstract

Hintergrund und Ziele: Die perinatale Hypoxie ist eine der häufigsten Ursachen für Hypoxisch-ischämische Enzephalopathie (HIE). Das Ausmaß und die Prognose der zerebralen Schädigung hängen vom Gestationsalter der Neugeborenen und somit vom zerebralen Reifungsgrad ab. Durch eine perinatale Hypoxie werden außerdem endogene Protektionskaskaden aktiviert, unter denen der Hypoxie-induzierbare Faktor (HIF) die größte Bedeutung hat. Als Transkriptionsfaktor reguliert HIF die Expression einer Vielzahl von Genen. Dazu zählen der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und die induzierbare NO-Synthase (iNOS), die in die reaktive Gefäßregulation involviert sind. Ein weiterer wichtiger Faktor der neuronalen Schädigungskaskade ist das proapoptotische Enzym Caspase-3. Zur Therapie einer HIE stehen bislang keine spezifischen neuroprotektiven Behandlungsoptionen zur Verfügung. Levetiracetam (LEV) ist ein Antikonvulsivum der neueren Generation, das tierexperimentell neuroprotektive Eigenschaften zeigte. Daten zu Effekten von LEV auf neurotrophe und vasoaktive HIF-regulierte Faktoren unter Hypoxie im unreifen Gehirn sind bislang in der Literatur nicht verfügbar. Ziel vorliegender Arbeit war die Charakterisierung von zerebralen vasoaktiven und neurotrophen HIF-regulierten Mechanismen infolge akuter systemischer Hypoxie im extrem unreifen Gehirn. Ein weiteres Ziel war die Analyse des Einflusses von Levetiracetam auf die Hypoxie-induzierten neurotrophen und vasoaktiven Faktoren. Methoden: Mittels RT-PCR wurden 1) die zerebrale mRNA-Expression von den HIF-abhängigen Genen VEGF und iNOS, sowie von den Hypoxie-induzierbaren, HIF-unabhängigen Genen nNOS, eNOS und Caspase-3 unter akuter systemischer Hypoxie (8% O2, 6h) und 2) der Einfluss von LEV (50mg/kg) auf die Expression oben genannter Gene unter Hypoxie und Normoxie analysiert. Die Untersuchungen wurden in zwei unterschiedlichen Entwicklungsstadien (P0, P7) des unreifen Gehirns am Modell der neonatalen Maus durchgeführt. Die statistische Auswertung der ermittelten Daten erfolgte mit der GraphPad PRISM Version 4.0 Software. Ergebnisse und Beobachtung: Akute Hypoxie führte zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression von VEGF und zu einer signifikanten Reduktion der mRNA-Expression von iNOS im Alter von P0 und P7. Im Gegensatz dazu wiesen die mittleren mRNA-Konzentrationen von nNOS, eNOS und Caspase-3 unter Hypoxie keine signifikante Veränderung weder im Alter von P0 noch P7 auf. Unter Normoxie zeigte die Gabe von LEV weder zum Zeitpunkt P0 noch P7 eine signifikante Beeinflussung der mRNA-Expression von VEGF und iNOS. Unter Hypoxie stieg im Gehirn der LEV-behandelten Tiere zu beiden Zeitpunkten P0 und P7 die Expression der VEGF-mRNA signifikant an. Die mRNA-Expression von iNOS zeigte nach einer LEV-Therapie unter Hypoxie eine signifikante Reduktion ausschließlich im Alter von P7. Im Gegensatz hierzu kam es zum Zeitpunkt P0 zu keinem signifikanten Abfall der iNOS-mRNA-Expression. Bei den Konzentrationen von nNOS, eNOS und Caspase-3 konnten nach der Gabe von LEV zu keinem Zeitpunkt weder unter Normoxie noch Hypoxie signifikante Veränderungen festgestellt werden. Praktische Schlussfolgerung: Zusammenfassend zeigte sich unter akuter Hypoxie eine signifikante Veränderung der mRNA-Expression HIF-abhängiger Faktoren zum Zeitpunkt P0 und P7. Dies unterstützt die These, dass HIF bei der Regulation von zerebraler Hypoxie im unreifen Gehirn eine Schlüsselrolle spielt. Desweiteren zeigte die Gabe von LEV keine wesentliche Beeinflussung der Expression HIF-abhängiger und HIF-unabhängiger Gene. Dies legt nahe, dass LEV weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen signifikanten Effekt auf endogene Protektionsmechanismen des unreifen Gehirns aufweist. Um einen möglichen neuroprotektiven Effekt von LEV unter Hypoxie im unreifen Gehirn der Maus beurteilen zu können, sind weitere Studien geplant.

DOI
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