Charakterisierung von potenziell neuen Melanom-relevanten Genen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2020-02-03
Issue Year
2020
Authors
Ascher, Sophia
Editor
Abstract

Hintergrund und Ziele: Da es von großem Interesse ist, das Verständnis für die Entstehung und die Progression des Melanoms zu erweitern, war das Ziel dieser Arbeit, Gene zu analysieren, die möglicherweise eine Rolle in diesen Prozessen spielen. Zu den zehn Genen CRIPTO, OAS2, EZH2, FOXM1, HMGB2, MAGOH, ADAR1, TRIM23, OAS1 and TRIM22, die durch cDNA Array Analysen vorausgewählt wurden, finden sich in der Literatur bereits aussichtsreiche Beobachtungen bei unterschiedlichen Erkrankungen wie Tumoren oder viralen Infekten. Durch die Untersuchung der Gen-Expressionsraten in Melanozyten, Melanom- und Metastasenzelllinien sowie in ‚Melanoblast-verwandten Zellen’ (= ‚melanoblast- related cells’, MBrc) und durch die Transfektion von Mel-Im Zellen sollte aufgezeigt werden, inwieweit diese Gene einen Einfluss auf die Pathogenese des Melanoms haben.

Methoden: Die Methoden, die in dieser Arbeit verwendet wurden, umfassen quantitative Real Time PCR (qRT-PCR)-Analysen, Western Blot-Auswertungen, immun- histochemische Expressionsanalysen und vektorielle Transfektionen von Mel-Im Zellen. Zudem wurden funktionelle Assays mit den transfizierten Zellen durchgeführt, wie Clonogenic Assays, Scratch Assays und Analysen mit Hilfe des Real Time Cell Analyzers. Darüber hinaus erfolgte die Züchtung stabiler Klone (stabile Transfektion) und die Behandlung von nicht-transfizierten Mel-Im Zellen mit Interferon.

Ergebnisse und Beobachtungen: Es wurden zunächst die Expressionslevel der Gene in diversen Melanomzelllinien aus Primärtumoren und Metastasen mit normalen humanen epidermalen Melanozyten (NHEM) mittels qRT-PCR verglichen. Zwei Gene, CRIPTO und OAS2 konnten aufgrund Primer-Etablierungsproblemen nicht weiterverfolgt werden. Vier weitere Gene EZH2, FOXM1, HMGB2 und MAGOH waren in Metastasen- und Primärmelanomzelllinien hochreguliert im Vergleich zu NHEM. TRIM23 zeigte in Primärmelanom- und Metastasenzelllinien eine nicht-signifikante Herabregulation. Die Gene OAS1, TRIM22 und ADAR1, auf die sich die Arbeit fokussierte, zeigten sich signifikant herabreguliert sowohl in Primärmelanom- als auch in Metastasenzelllinien. Dieses Resultat konnte auch auf Proteinebene bestätigt werden. Auch immunhistochemisch wurden TRIM22 und OAS1 in Nävuszellnävi, Metastasen und Primärtumoren untersucht. TRIM22 zeigte auch dort eine stark positive Färbung von TRIM22 in Nävi im Vergleich zu den schwachen Färbungen in Melanom- und Metastengeweben. OAS1 zeigte sich zwar sehr spezifisch gefärbt in Melanozyten von Nävuszellnävi, es konnte jedoch, im Gegensatz zu den Ergebnissen der qRT-PCR- und Western Blot-Analysen, keine deutlich schwächere Färbung in Melanom-und Metastasengeweben festgestellt werden. Durch vektorielle Transfektion von OAS1 in Mel-Im Zellen konnten funktionelle Tests durchgeführt werden. Es wurden nicht-signifikante Verringerungen der Koloniebildungsfähigkeit und der Proliferationsrate festgestellt. Im Wundheilungstest zeigte sich kein Unterschied im Hinblick auf das Migrationsverhalten verglichen mit der Kontrolle. Das Erstellen stabiler Klone mit OAS1-Überexpression ist nicht gelungen. Wie in der Literatur beschrieben, können Prozesse und Gene, die in der Embryogenese eine Rolle spielen, im Melanom wieder aktiviert werden. Dazu wurden die Expressionsraten der Gene in MBrc mit denen in NHEM auf mRNA-Ebene verglichen. Die qRT-PCR lieferte interessanterweise bei Betrachtung der Expressionsraten von MBrc und von Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten eine sehr ähnliche Tendenz. So zeigte sich stets entweder eine Überexpression oder eine Herabregulation der Expressionsraten in MBrc und Melanomzelllinien im Vergleich zu NHEM. Des Weiteren wurde die Interferon-Induzierbarkeit der Gene TRIM22, OAS1 und ADAR1 mittels qRT-PCR nachgewiesen.

Schlussfolgerungen: Zusammenfassend sind die Gene, insbesondere TRIM22, OAS1 und ADAR1, vielversprechende Ansatzpunkte für das Verständnis der Pathogenese des Melanoms. Es sind jedoch weitere Studien zu biochemischen und molekularbiologischen Abläufen im Melanom erforderlich. Ob diese Gene therapeutische Ansatzpunkte darstellen, die auch in die Praxis umgesetzt werden können, wird sich erst in Zukunft herausstellen.

DOI
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