Herstellung und Charakterisierung unterschiedlicher bi- und trispezifischer Antikörperderivate zur Therapie der Akuten Myeloischen Leukämie

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-10-26
Issue Year
2009
Authors
Singer, Heiko W.
Editor
Abstract

Despite improvement of AML therapy by new therapeutic approaches, potent antibody-derived agents for treatment of acute myeloid leukemia (AML) are still lacking. Bi¬specific antibody molecules are attractive, but there are some limitations of the monovalent formats. Single-chain Fv triplebodies (sctb), consisting of one poly¬peptide chain with three single-chain antibody variable fragments (scFvs) connected in tandem, were generated as anti-leukemic agents. A CD19 specific sctb of this format has previously been shown to be superior to a bispecific single-chain Fv antibody fragment (bsscFv) for the elimination of B-cell leukemic cells. For targeted therapy of AML, both a bsscFv and a sctb specific for CD33 and the trigger molecule CD16 (FcγRIII) were constructed. The sctb displayed 3.5-fold greater avidity for CD33 than the bsscFv 33xds16, while both had almost equal affinity for CD16. In antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) reactions with human mononuclear cells as effectors, both the bsscFv 33xds16 and the sctb induced lysis of tumor cells with half-maximum effective concentrations (EC50) in the low picomolar range. Interestingly, the sctb promoted equal lysis of human leu¬kemic cell lines at 10- to 200-fold lower concentrations than the bsscFv. Both molecules were able to induce ADCC of primary patient cells. In conclusion, the bsscFv 33xds16 and the sctb 33x16x33 eliminated AML cells in ADCC reactions, with the novel sctb format showing significantly higher specific activity. A critical feature of therapeutic molecules is their selectivity against tumor cells. In cont¬rast to normal myeloid cells, some AML blasts co-express lymphoid and myeloid anti¬gens on one cell. In this case selectivity of the therapeutic might be improved by dual targeting, choosing a combination of target antigens exclusively existing on tumor cells. A dual targeting sctb 33xds16xds19 was generated, which is specific for two different target antigens at the same time: the lymphoid antigen CD19 and the myeloid antigen CD33. Malignant cells are eliminated via recruitment of Natural Killer (NK) -cells over the trigger molecule CD16. The addition of a third scFv moiety with a third specificity neither had negative impact on the affinity of the binding sites nor on the stability of the molecule in human serum in vitro. No avidity effect on the CD33/CD19 double-positive cell line BV-173 was seen for the sctb. It was able to induce ADCC of a antigen double-po¬si¬tive cell line. Those data indicate that sctbs are attractive molecules for targeted the¬rapy of AML and warrant further pre-clinical investigation.

Abstract

Trotz zahlreicher Verbesserungen der AML Therapie durch neue Medikamente, besteht immer noch ein Mangel an attraktiven Antikörper-basierten Therapeutika für die Behandlung der AML. Bispezifische Antikörpermoleküle stellen dabei eine attrak¬tive Alternative dar, es gibt aber einige Einschränkungen der monovalent bin-denden Formate. Deshalb wurden single-chain Fv triplebodies (sctb), bestehend aus drei single-chain antibody variable Fragments (scFv), die zu einer Polypeptidkette fusioniert sind, als Substanzen zur Behandlung von Leukämien hergestellt. Für einen CD19 spezi¬fischen sctb wurde gezeigt, dass er effektiver B-Zellen eliminieren konnte als ein bispezifischer scFv (bsscFv). Für die zielgerichtete AML-Therapie wurde deswegen sowohl ein bsscFv als auch ein sctb, beide spezifisch für CD33 und das trigger Molekül CD16 (FcγRIII), hergestellt. Der sctb zeigte eine 3,5-fach höhere Avidität für CD33 als der bsscFv 33xds16, wohingegen beide Moleküle die selbe Affinität für CD16 hatten. In Versuchen zur Antikörper-vermittelten zellulären Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) mit humanen Mononukleären Zellen (MNC) als Effektorzellen, induzierten sowohl der bsscFv als auch der sctb Lyse der Tumorzellen mit halbmaximaler effektiver Konzentration (EC50) im niedrigen picomolaren Bereich. Interessanterweise vermittelte der sctb gleiche Lyse von humanen Leukämiezelllinien bereits bei 10-200-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv. Beide Moleküle waren in der Lage, ADCC primärer Leukämiezellen zu induzieren. Zusammengefasst sind sowohl der bsscFv 33xds16 als auch der sctb 33xds16x33 in der Lage, AML Zellen in ADCC Reaktionen zu eliminieren, wobei das neue sctb Format signifikant höhere spezifische Aktivität aufwies. Eine wichtige Eigenschaft therapeutischer Moleküle ist ihre Selektivität gegenüber Tumorzellen. Im Gegensatz zu normalen myeloischen Zellen, koexprimieren manche AML Blasten lymphoide und myeloide Antigene auf einer Zelle. In diesem Fall könnte die Selektivität durch duales targeting erhöht werden, indem man eine Kombination von Zielantigenen auswählt, die nur auf Tumorzellen vorkommt. Ein dual-targeting sctb 33xds16xds19 wurde hergestellt, der spezifisch für zwei unterschiedliche Zielantigene ist: das lym¬phoide Antigen CD19 und das myeloide Antigen CD33. Malig¬ne Zellen werden durch Rekrutierung von NK-Zellen über das trigger-Molekül CD16 eliminiert. Das Hinzufügen des dritten scFv-Bestandteils einer dritten Spezifität hatte keinen negativen Einfluss auf die Affinität der Bindeköpfe oder die Stabilität der Moleküle in humanem Serum in vitro. Ein Aviditätseffekt auf der CD33/CD19 doppelt-positiven Zelllinie BV-173 wurde nicht beobachtet. Der sctb war in der Lage ADCC dieser doppelt-positiven Zelllinie zu induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sctbs attraktive Moleküle für die zielgerichtete Therapie der AML sind, die in weiteren präklinischen Versuchen untersucht werden sollten.

DOI
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