The insulator protein CTCF and cohesins are critical for Herpesvirus saimiri genome maintenance

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-03-23
Issue Year
2012
Authors
Zielke, Katrin
Editor
Abstract

After a primary lytic infection, all members of the herpesvirus family establish latency in suitable cells of a host organism. Subgroup C strains of Herpesvirus saimiri (HVS), the prototype of the gamma-2-herpesviruses, are able to latently infect and transform human T lymphocytes to stable, antigen-independent growth in vitro. The viral genomes persist as non-integrated, circular and histone-associated episomes within the nuclei of such T cells. During the state of latency most of the viral genes are silenced and only a few latency-associated genes are expressed. This enables the virus to persist lifelong within the latently infected cells and to escape from the host immune system. Epigenetic modifications of viral episomes such as DNA methylation, histone modifications, chromatin boundary formation and DNA looping are involved in the restriction of viral gene transcription during latency. A key regulator involved in the organization of the three dimensional architecture of DNA and of long distance chromosomal interactions, is the nuclear DNA binding protein CTCF. This study addressed the presence and the influence of CTCF binding sites (CBS) within the HVS genome. The localization of two putative CBS at the HVS orf73/orf74 intergenic region was validated by several independent methods. Analysis of the activities of the orf73 and orf74 promoter regions, revealed an influence of CTCF on their promoter functions. Additionally, two subunits of the cohesin complex, SMC3 and Rad21, were found to colocalize at the two CBS, arguing for a supportive role of such proteins in CTCF function. Moreover, the generation and analysis of HVS recombinants, harboring mutations or deletions of the CBS, indicated that lytic replication of such viruses is not substantially influenced by CTCF; neither the release of infectious progeny virus nor the protein expression patterns of the distinct virus mutants were altered in comparison to wild type HVS. However, T cells latently infected with CBS mutant viruses were impaired in their proliferation abilities and showed a significantly reduced episomal stability. Transcriptional analysis of the orf73 gene product, which is central in the maintenance of viral episomes in dividing T cell populations, revealed a reduction in the expression level in mutant virus-infected T cells which might contribute to the loss of HVS episomes. Finally, shRNA assays confirmed the contribution of CTCF to HVS episomal maintenance. These data demonstrate that the episomal stability of HVS genomes in latently infected human T cells is crucially dependent on epigenetic mechanisms mediated by CTCF, which might be supported by effects conferred by subunits of the cohesin complex.

Abstract

Für alle Mitglieder der Herpesvirusfamilie konnte gezeigt werden, dass sie nach einer primären lytischen Infektion den Zustand der sogenannten Latenz in geeigneten Wirtszellen etablieren können. Stämme der Untergruppe C des Herpesvirus saimiri (HVS), welches den Prototyp der gamma-2-Herpesviren darstellt, sind in der Lage humane T-Lymphozyten latent zu infizieren und zu einem Antigen-unabhängigen Wachstum in vitro zu transformieren. Die viralen Genome persistieren in hoher Kopienzahl in den Kernen dieser T-Zellen als nicht-integrierte, zirkularisierte und mit Histonen assoziierte Episomen. Während des Zustands der Latenz sind die meisten viralen Gene reprimiert und nur wenige, für die Latenz essentielle Gene, werden transkribiert. Epigenetische Modifikationen der viralen Episomen wie DNA Methylierung, Histon Modifikationen, Ausbildung von Chromatingrenzen sowie DNA Schleifenbildung sind beteiligt and der Regulation der viralen Genexpression während der Latenz. Ein Schlüsselprotein, welches die dreidimensionale Architektur der DNA sowie chromosomale Interaktionen weit entfernter Regionen organisiert, ist das nukleäre DNA-bindende Protein CTCF. Ziel dieser Arbeit war es das Vorkommen und den Einfluss von CTCF Bindungsstellen (CBS) innerhalb des HVS Genoms zu klären. Die Lokalisation von zwei potentiellen CBS in der intergenischen Region von orf73/orf74 konnte durch mehrere Versuche bestätigt werden. Die Analyse der Promotoraktivität von orf73 und orf74 offenbarte einen Einfluss von CTCF auf die jeweilige Promotorfunktion. Darüber hinaus konnte eine Kolokalisation zweier Untereinheiten des Kohesin-Komplexes, SMC3 und Rad21, an den beiden CBS gezeigt werden. Dies spricht für eine unterstützende Rolle dieser Proteine zur CTCF Funktion. Durch die Generierung und die Analyse von HVS Rekombinanten, die Mutationen der CBS beinhalteten, konnten Indizien gewonnen werden, dass CTCF die lytische Replikation von HVS nicht substantiell beeinflusst; weder die Freisetzung infektiöser Nachkommenviren noch die Proteinexpression der Virusmutanten unterschied sich vom Wildtyp. Jedoch waren T-Zellen, welche latent mit den mutanten Viren infiziert waren, stark eingeschränkt in ihrer Fähigkeit zu proliferieren und es konnte eine signifikante Reduktion der episomalen Stabilität detektiert werden. Außerdem wurde eine verringerte Transkription von orf73 gezeigt, welches für die episomale Persistenz essentiell ist und somit zu dem erhöhten Verlust der HVS Episomen beitragen könnte. Zuletzt validierten shRNA Versuche die Beteiligung von CTCF an der episomalen Aufrechterhaltung der HVS Genome in den infizierten T-Zellen. Diese Daten demonstrieren, dass die episomale Stabilität der HVS Genome in latent infizierten, humanen T-Lymphozyten stark von epigenetischen Mechanismen abhängt welche durch CTCF vermittelt werden und welche durch Effekte der Untereinheiten des Kohesin-Komplexes unterstützt werden könnten.

DOI
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