Transcriptomic characterization and improvement of immunotherapy in Merkel cell carcinoma

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Year
2023
Authors
Sauerer, Tatjana
Editor
Abstract

Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare, but highly aggressive neuroendocrine skin cancer, mainly caused by the Merkel cell polyomavirus. This virus can lead to MCC via integration into the host genome and expression of a truncated version of one of its proteins, called Large T antigen (truncLT). MCC is an immunogenic tumor that constantly needs to escape immune surveillance for example by aberant expression of the programmed cell death-protein 1/-ligand 1 (PD-1/PD-L1) or of the human leukocyte antigen (HLA). In context of cellular immunity, IFNɣ is a key cytokine mainly produced by activated lymphocytes. Although producing a variety of anti-tumoral effects, it paradoxically also exerts immunomodulatory functions which are misused by the tumor. Hence, a comprehensive understanding of the transcriptomic response of MCC cells to IFNɣ is of high interest. For this, three MCC cell lines were incubated with IFNɣ and the transcriptomic alterations were analyzed by single-molecule RNA sequencing using the Oxford Nanopore platform. Numerous significantly differentially expressed genes could be detected across all three cell lines as well as a clear upregulation of genes involved in tumor immune escape, suggesting these genes as potential targets in MCC immunotherapy. Furthermore, the transcriptome of a primary MCC and the corresponding cell culture were compared to each other and numerous alterations regarding tumor infiltrating lymphocytes, biomarker and immunosuppressive molecules were detected. In metastatic MCC, the treatment with checkpoint inhibitors (CPIs) has shown high clinical response rates of up to 60 %, but as nearly half of the patients do not respond to this treatment additional therapeutic options are urgently needed. For improvement of immunotherapy in MCC it was hypothesized that the combination of dendritic cell (DC) vaccination against the truncLT with checkpoint blockade could be an effective way to induce a strong and better immune response than each treatment alone. Therefore, the immunogenic potential of DCs loaded with the truncLT in presence or absence of three different CPIs (Ipilimumab, Pembrolizumab, Avelumab) was evaluated using the well-established human ex vivo cell culture system and the fraction of T cells, specific for the truncLT was determined by IFNɣ ELISPOT assays. Checkpoint inhibition had substantial effects on quantity and quality of antigen-specific T cells in healthy donors. Ipilimumab (anti-CTLA-4) strongly decreased the T-cell responses, Pembrolizumab (anti-PD-1) either drastically increased, or decreased the number of specific T cells and in presence of Avelumab (anti-PD-L1) a lower number of truncLT-specific T cells was detected. Furthermore, it was demonstrated that Avelumab results in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) by binding on DCs and activating the NK cells, which then killed the DCs in the co-culture system finally leading to ineffective T-cell priming. Based on these data Avelumab should not be considered for combination with DC-based immunotherapy neither in MCC nor in other malignancies. In conclusion, the immunological characterization of MCC cell lines demonstrated an upregulation of immune escape genes after IFNɣ treatment and regarding the combination of CPIs and DC vaccines an Avelumab-mediated ADCC towards DCs via NK-cell activation was revealed. These data contribute to better understanding of T-cell responses under CPI influence and immune evasion in MCC what can lastly improve immunotherapy of MCC patients.

Abstract

Das Merkelzellkarzinom (MZK) ist ein seltender aber hochagressiver neuroendokriner Hautkrebs, welcher größtenteils durch das Merkelzellpolyomavirus ausgelöst wird. Dieses Virus kann durch Integration in das Wirtsgenom und durch Expression einer trunkierten Version eines seiner Proteine, des Large T Antigen‘s (trunkLT), zum MZK führen. Das MZK ist ein immunogener Tumor, welcher durchgehend der Kontrolle des Immunsystems entfliehen muss, z.B. durch abnormale Expression bestimmter Proteine, wie des programmed cell death-protein 1/-ligand 1 (PD-1/PD-L1) oder des humanen Leukozyten-Antigens (HLA). Wenn man die zelluläre Immunität betrachtet, ist Interferon-gamma (IFNɣ) ein Schlüssel-Zytokin, welches überwiegend von aktivierten Lymphozyten sekretiert wird. Obwohl es eine Vielzahl an anti-tumoralen Effekten bewirken kann, gehören paradoxerweise auch immun-modulatorische Funktionen zu seinem Repertoire, welche vom Tumor zweckentfremdet werden. Deswegen ist ein umfassendes Veständnis der transkriptionellen Antwort von MZK-Zelllinien auf IFNɣ von großem Interesse. Hierfür wurden drei MZK-Zelllinien mit IFNɣ inkubiert und Veränderungen in ihrem Transkriptom durch Einzelmolekül-RNA-Sequenzierung mit Hilfe der Oxford Nanopore Platform analysiert. Zahlreiche Gene, welche signfikant differentiell exprimiert waren, konnten in allen drei Zelllinien nachgewiesen werden, außerdem eine starke Hochregulation von Genen, die eine Rolle spielen, wie der Tumor der Kontrolle des Immunsystems entkommt. Diese Gene stellen potentielle neue Ziele für die Immuntherapie im MZK dar. Zudem wurden das Transkriptom eines Primärtumors sowie der daraus generierten Zellkultur miteinander verglichen, wobei zahlreiche Veränderungen festgestellt werden konnten, insbesondere bezüglich Tumor-infiltrierender Lymphozyten, Biomarkern und immunsuppressiv-wirkender Molekülen. Im metastasierenden MZK zeigte die Behandlung mit Checkpoint Inhibitoren (CPIs) sehr gute klinische Ansprechraten bis zu 60 %. Da jedoch umgekehrt fast die Hälfte der Patienten nicht auf diese Behandlungsmethode anspricht, werden weitere Therapieoptionen dringend benötigt. Um die Immuntherapie im MZK zu verbessern, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Kombination aus Vakzinierung mit dendritischen Zellen (DZs) gegen das trunkLT zusammen mit CPI Behandlung eine stärkere und bessere Immunantwort induzieren könnte, als DZ-Vakzine oder CPIs alleine. Hierfür wurde das immunogene Potential von DZs, die mit dem trunkLT beladen worden waren, in An- oder Abwesenheit von CPIs (Ipilimumab, Pembrolizumab, Avelumab) evaluiert, wobei ein gut etabliertes humanes ex-vivo Zellkultursystem eingesetzt wurde. Der Anteil an T-Zellen, die spezifisch für das trunkLT waren, wurde mittels IFNɣ ELISPOT-Assay bestimmt. Die Anwesenheit von CPIs hatte einen wesentlichen Effekt auf die Qualität und Quantität von Antigen-spezifischen T-Zellen in gesunden Spendern. Ipilimumab (anti-CTLA-4) führte zu einem starken Abfall an T-Zellantworten, Pembrolizumab (anti-PD-1) zeige zwei drastische Effekte, indem die Anzahl an spezifischen T-Zellen entweder stark erhöht oder stark erniedrigt war, und Avelumab (anti-PD-L1) führte zu einer deutlich niedrigeren Anzahl an trunkLT-spezifischen T-Zellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Avelumab an die DZs bindet und die natürlichen Killerzellen stark aktiviert, welche durch antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (AZZ) die DZs in unserem Kokultursystem eliminierten, was letztlich zum ineffektiven T-Zell-Priming führte. Basierend auf diesen Daten, sollte Avelumab nicht in Kombination mit DZ-basierter Immuntherapie in Betracht gezogen werden, weder für das MZK noch für andere Tumorarten. Abschließend lässt sich sagen, dass die immunologische Charakterisierung von MZK-Zelllinien eine Hochregulation von Immunevasions-Genen nach Inkubation mit IFNɣ aufdeckte und außerdem im Rahmen der Kombination von CPIs und DZ-Vakzinen die Avelumab-vermittelte AZZ gegen DZs durch NK-Zell-Aktivierung aufgezeigt werden konnte. Diese Daten tragen zu einem besseren Verständnis von T-Zellantworten unter CPI-Einfluss sowie der Immunevasion im MZK bei, was letztlich die Immuntherapie von MZK Patienten verbessern kann.

DOI
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