Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α für das Zystenwachstum bei polyzystischen Nierenerkrankungen.

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2016-12-19
Issue Year
2016
Authors
Kraus, Andre
Editor
Abstract

Patients suffering from Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) develop multiple cysts in both kidneys. These cysts enlarge continuously over time, thereby compressing adjacent healthy kidney tissue. This results in a loss of kidney function and frequently the need for continuous renal replacement therapy in adults. In 85% of the ADPKD cases, a mutation in the PKD1-gene, which encodes for Polycystin-1, causes cyst formation. However, the mechanisms leading to progressive cyst growth remain incompletely understood. Cystic kidneys are exposed to low oxygen tensions which leads to activation of the hypoxia-inducible transcription factor HIF-1α in the cyst-lining epithelial cells. Data obtained in an in vitro cyst model have shown, that HIF-1α can promote cyst enlargement by activation of calcium-activated chloride secretion. Whether these findings are relevant to the in vivo situation has so far been unclear. Hence, the aim of this work was to analyze the impact of HIF-1α on cyst enlargement in in vivo. Therefore, a tubule-specific, inducible Pkd1-Hif-1α-double knockout mouse was generated and its phenotype was compared with an established inducible Pkd1-knockout mouse with regards to cyst progression and kidney function. In addition, the aime was to study the effect of pharmacological induction of HIF-1α in both mouse lines. Based on these findings we aimed to further analyze the role of HIF-1α regulated proteins potentially involved in cyst progression in an in vitro cyst model. Tamoxifen-dependent tubule-specific Pkd1-knockout was induced at postnatal day 35-37 in a mouse line (KspCreERT2;Pkd1fl;fl), in order to obtain a moderate cystic phenotype after 3 months of observation. Morphometric analyses were performed to detect changes in cystic burden and renal function was assessed by measuring creatinine and urea. These findings were correlated with the expression of HIF-1α and the HIF-1α target gene glucose transporter type 1 (GLUT-1). Pkd1-knockout KspCreERT2;Pkd1fl;fl mice resulted in a mild cystic phenotype without detectable impact on renal function and without any effect on the expression of HIF-1α compared to non-induced control animals. Some mice received the prolylhydroxylase (PHD)-inhibtor ICA (40 mg/kg b.w.) 5x/week in order to stabilize HIF-1α. Application of ICA resulted in a significant rise of HIF-1α expression in cyst epithelial cells of KspCreERT2;Pkd1fl;fl kidneys and a strong aggravation of the cystic phenotype. In line with the phenotypic changes, a significant increase in plasma creatinine and plasma urea levels was found and animals showed increased mortality. Furthermore, we generated mice which, in addition to Pkd1, also had an inducible tubule-specific knockout of Hif-1α (KspCreERT2;Pkd1fl;fl;Hif-1αfl;fl) and treated some of these mice also with ICA. Mice with a tubular knockout of Hif-1α in addition to Pkd1 also showed a mild cystic phenotype and normal renal function, comparable to the KspCreERT2;Pkd1fl;fl mice. However, in contrast to the KspCreERT2;Pkd1fl;fl mice, KspCreERT2;Pkd1fl;fl;Hif-1αfl;fl mice were protected against ICA-dependent aggravation of cyst growth, which was reflected by a much milder cystic phenotype, better renal function and improved survival rate. This protection appeared not to be due to a change in cell proliferation, nor apoptosis rate or the degree of macrophage infiltration. However, tubular deletion of HIF-1α was highly correlated with a decrease in fibrosis and a decrease in Anoctamin 1- and P2Y2R expression, further pointing towards a role of HIF-1α in calcium-activated chloride secretion. In order to test for the impact of P2Y2R on cyst growth, we generated P2Y2R-deficient MDCK-cells and analyzed cyst enlargement within a collagen matrix. Stable P2Y2R-deficient MDCK cysts had reduced growth rates and lacked ATP- and ICA-dependent cyst enlargement compared to control-transfected cysts. Therefore, we could conclude that HIF-1α has a significant impact on cyst progression in an orthologous PKD1 mouse model. The underlying mechanism is likely to include HIF-1α-dependent transcriptional regulation of genes that are involved in calcium-activated chloride secretion into the cyst lumen in cyst lining epithelial cells. In conclusion, HIF-1α as well as downstream-regulated genes, such as P2Y2R could qualify as potential targets for future therapeutic interventions in order to inhibit cyst growth and preserve renal function in ADPKD.

Abstract

Bei der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) entstehen zahlreiche Zysten in beiden Nieren, die über Jahrzehnte hinweg kontinuierlich wachsen und dabei gesundes Nierengewebe verdrängen. Dies mündet in einem Verlust der Nierenfunktion und häufig der Notwendigkeit zur Durchführung einer dauerhaften Nierenersatztherapie im Erwachsenenalter. In 85% der Fälle ist die Ursache eine Mutation im PKD1-Gen, welches für Polycystin-1 kodiert und dessen Verlust zur Zystenbildung führt. Die Gründe für das progrediente Zystenwachstum sind bislang unzureichend verstanden. Zystennieren weisen ein hohes Maß an Hypoxie auf, was zu einer Aktivierung des Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors HIF-1α im Zystenepithel führt. Vorarbeiten in einem in vitro Zystenmodell zeigten, dass HIF-1α das Zystenwachstum fördern kann, indem es zu einer vermehrten Kalzium-aktivierten Chloridsekretion führt. Inwieweit diese Befunde für die Progression der Zysten in vivo relevant sind, war aber bislang unklar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Rolle von HIF-1α für das Zystenwachstum bei polyzystischer Nierenerkrankung in vivo zu untersuchen. Hierzu sollte eine tubulusspezifisch induzierbare Pkd1-Hif-1α-Doppelknockout Mauslinie generiert und mit einer etablierten induzierbaren Pkd1-Knockoutmaus hinsichtlich der Zystenprogression verglichen werden. Zudem sollte der Einfluss einer pharmakologischen Induktion von HIF-1α in den beiden Mauslinien untersucht werden. Aufbauend auf den Befunden sollte die Rolle potentieller, an der Zystenprogression beteiligter HIF-1α-regulierter Proteine in einem in vitro Zystenmodell weiter analysiert werden. In einem Tamoxifen-induzierbaren, tubulusspezifischen Pkd1-Knockout Mausmodell (KspCreERT2;Pkd1fl;fl) wurde durch eine Induktion des Knockouts an Tag 35-37 nach Geburt ein moderater zystischer Phänotyp induziert und der Verlauf über 3 Monate beobachtet. Nach Ende der Behandlung wurde morphometrisch das Ausmaß des Zystenwachstums sowie der Einfluss auf die Nierenfunktion durch Bestimmung von Kreatinin und Harnstoff untersucht und die Ergebnisse mit dem Ausmaß der Expression von HIF-1α sowie des HIF-1α-Zielgens Glukosetransporter 1 (GLUT-1) korreliert. Die Induktion des PKD1-Knockouts in KspCreERT2;Pkd1fl;fl Mäusen führte erwartungsgemäß zu einem gering ausgeprägten zystischen Phänotyp ohne erkennbaren Einfluss auf die Nierenfunktion und ohne nennenswerten Einfluss auf die Expression von HIF-1α im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrolltieren. Einem Teil der Tiere wurde 5x/Woche der Prolylhydroxylase (PHD)-Inhibitor ICA (40 mg/kg KG) zur Induktion von HIF-1α verabreicht. Die Gabe von ICA führte zu einer signifikant gesteigerten Expression von HIF-1α im Zystenepithel der KspCreERT2;Pkd1fl;fl Nieren und ging einher mit einer erheblichen Zunahme des zystischen Phänotyps. Des Weiteren zeigte sich in den ICA behandelten Tieren ein deutlicher Anstieg von Kreatinin und Harnstoff sowie eine erhöhte Mortalität. Zusätzlich wurden Mäuse, die neben Pkd1 auch einen induzierbaren Knockout für Hif-1α aufwiesen (KspCreERT2;Pkd1fl;fl;Hif-1αfl;fl) generiert, von denen wiederum ein Teil zusätzlich mit ICA behandelt wurde. Im Gegensatz zu den KspCreERT2;Pkd1fl;fl Mäusen waren die KspCreERT2;Pkd1fl;fl;Hif-1αfl;fl Mäuse jedoch geschützt vor den ungünstigen Effekten der ICA-Gaben, was sich in einem signifikant gebesserten zystischen Phänotyp, verbesserter Nierenfunktion und besserem Überleben widerspiegelte. Dieser Unterschied war weder durch Veränderungen im Ausmaß der Zellproliferation, der Apoptoserate noch der Makrophageninfiltration erklärbar. Die tubuläre Deletion von HIF-1α ging aber mit einer verminderten Fibrose sowie einer geringeren Expression von Anoctamin 1 und P2Y2R einher, die eine potentielle Rolle bei der Kalzium-aktivierten Chloridsekretion spielen könnten. Zur weiteren Analyse der Rolle von P2Y2R für das Zystenwachstum generierten wir stabile P2Y2R-defiziente MDCK-Zellen und untersuchten den Einfluss auf das Zystenwachstum in einer Kollagenmatrix. Stabil P2Y2R-defiziente MDCK Zysten zeigten im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zysten ein reduziertes Wachstum und eine fehlende Größenzunahme durch ATP und ICA. Somit lässt sich schlussfolgern, dass HIF-1α eine wesentliche Rolle bei der Progression von Zystennieren in einem PKD1-orthologen Mausmodell spielt. Der zugrundeliegende Mechanismus könnte dabei in der transkriptionellen HIF-1α-abhängigen Regulation von Genen liegen, die an der Kalzium-aktivierten Chloridsekretion des Zystenepithels in das Zystenlumen beteiligt sind. Somit könnten sich sowohl HIF-1α als auch downstream regulierte Gene wie P2Y2R als zukünftige therapeutische Ziele zur Verminderung des Zystenwachstums in ADPKD qualifizieren.

DOI
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