Morphological analysis of epithelial cells

Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
Issue Year
Kaliman, Sara

The formation of an organism is complex interplay of various cell types which proliferate and reorganize until they form a fully grown living being. This process is governed by widely studied biochemical and genetic factors. The physical manifestation of those factors constitutes cell morphology, which arises from forces produced either by the cell or by its neighbors. Quantifying typical cell shapes dynamically and over different tissue regions would improve our understanding of normal and abnormal tissue morphologies which is essential for diagnosis but also it reveals many physical mechanisms underlying tissue growth. The process of tissue growth is a complex interplay of passive changes and active changes. The passive changes originate as a mechanical response of the cell to external forces, while the active changes arise from the energy consuming acto-myosin complex. Unraveling the differences between active and passive responses extends beyond biology to the realm of biophysics where the field of active matter is extensively studied. Therefore, the focus of this thesis is the morphological characterization of tissues at different length scales in order to identify important physical limitations and rules which govern tissue growth. As a model system we use unconstrained MDCK-II epithelial monolayers seeded at flat substrate with different rigidities. The thesis is organized into five chapters, the first of which is a general introduction into in-vivo and in-vitro models for tissue growth, collective cell behavior and cell mechanical properties. In the second Chapter, we analyze how epithelial cells tessellate the space between each other. It has been almost 40 years since it was suggested that epithelial space tessellation is similar to Voronoi tessellation. Relying on this result, numerous recent studies estimate cell morphology with Voronoi tessellation generated from cell nuclei centers of mass. However, the error of this approximation was never quantified. For the first time, we quantify the error of such approximation in respect to various morphological measures of a cell. Furthermore, we develop a novel and systematically more accurate method for reconstructing cell membranes from cell nuclei positions. To do so, we generate a tessellation from cell nuclei boundaries. The success of this tessellation must be found in a tight correlation between nuclei shapes and cell shapes at biologically relevant time scales. Since cell nuclei are more easily stained and segmented than cell membranes, this readily implemented method can be used widely and it builds a foundation for further morphological analysis of tissue. Since the method relies on precise nuclei identification, we develop and describe a novel routine for MDCK-II cell nuclei segmentation. In the third Chapter we characterize large MDCK-II colonies on glass substrates and polyacrylamide (PA) gels with various rigidity. Mechano-sensitivity was repeatedly confirmed for single cells, but once cells adhere to each other, they no longer seem to be sensitive to substrate rigidity. We show that, contrary to conventional wisdom, cells in large colonies are still mechano-sensitive. The evidence for this is found either on very soft substrates or -- in the case of harder substrates -- on long time scales. On soft underlying substrates, we observe a regime of growth not previously reported. The novel regime of growth starts with archipelago of 3D cell droplets which, upon reaching critical size, give rise to a cell monolayer characterized by very high and constant cell density. This monolayer is surrounded by 3D edge of unorganized cells which still divide. On the contrary, cells on harder substrates exhibit previously studied regime of MDCK-II growth. To further quantify this regime, we focus on morphological characterization of circular 2D cell colonies with initially uniform and low cell density. The colonies grow to large sizes, densify, and compartmentalize into bulk and edge regions. In the bulk region, cells undergo contact inhibition, whilst in the edge region, where cell density gradually decreases, cells move and proliferate. However, the distribution of cell density and cell colony area differs between hard gels and glass substrates. Moreover, steady state is always found at higher cell densities on hard gels than those on glass substrates. In the heart of these differences lies a different rate of cell proliferation. We found that large cells proliferate more on hard gels than on glass substrates. Also, both the nature and number of irregularities - which emerge in a monolayer structure with time - are very different on glass substrates. These in-vitro results indicate multiplex response of fully differentiated cells to rigidity of their surroundings. Characterizing growth of unconstrained circular epithelial colonies provides evidence of spontaneous large scale compartmentalization into bulk and edge regions. In the fourth Chapter, we report on our investigation of the necessary conditions for compartmentalization to emerge. Firstly, we measured cell velocity as a function of cell's radial distance from the center of the cluster. The results suggest that cell velocity linearly depends on cell position in the edge region of the cluster, whilst in the bulk region the value of cell velocity is constant. With our simulation, we successfully reproduce cluster morphology over a period of eight days. This success confirms that measurements of cell velocity, cluster area growth in time and cell proliferation probability are consistent with spontaneous compartmentalization of cell colonies. Moreover, we utilize the simulation as a testing tool for the effect of different cell behaviors on global morphology of cell clusters. Importantly, our experimental measurements expand conventional wisdom on cell collective behavior and proliferation. During colony growth cells organize with their nearest neighbors and change their shape. Movement and reorganization continue until steady state is reached. In the last Chapter we study density induced changes of cell shapes. We find that most of cell morphological measures change with cell density even though these measures do not depend on cell area. However, cells in steady state have the same morphological properties independent of cell density value. This result implies that steady state is defined by morphological organization and not by cell density as previously believed. Furthermore, we test similarities between organization of epithelial tissue and random packings of ellipses. Since cell nuclei are stiffer than cytoplasm, they occupy more and more of the total cell area as tissues densify. Thus, the ratio of cell nuclei and cell body area represents area packing fraction. This phenomenon enables a direct mapping between cell density and the area fraction of random packings. We therefore compare images of cell monolayers- covering the whole range of attainable cell densities- and random packing of mono-disperse and poly-disperse ellipses. The poly-disperse ellipses have the same areas and elongations as the cell nuclei in a given image. Probability distributions reveal unforeseen similarities between random packings of cell nuclei and real tissue, which were the most evident for tissues in steady state. On the other hand, correlation functions affirm that cell reorganization, which accompanies a rise in cell density, is a necessary consequence of increasing area fraction (this arises from relative stiffness of cell nuclei). However, some measures remain unchanged in the tissue. This suggests an active cell mechanism which keeps these measures constant as tissue densifies. However, the reason why cells want to keep, for example, cell elongation constant is yet to be understood. We have identified many important principles regulating tissue organization on different length scales. The image analysis tools we develop in this work can be helpful for a broader scientific community – for instance in diagnostics. Our work indicates there are several new biological phenomena not previously considered. First of all, we identify a fast shape-coupling between cell nuclei and membranes. Furthermore, we show that cells in a tissue feel and react to rigidity of their surroundings in a complex manner. The large-scale cell organization seen in our experiments withholds a plethora of not fully understood collective and individual cell behavior which we enrich with new information. Additionally, we discover striking similarities between tissue morphological properties and random ellipse packings which enables a new perception of cellular organization. All these phenomena open new perspective on the laws governing tissue formation. However, more studies are needed to deepen the presented results and reveal new laws beneath a fascinating process of tissue growth and organization.


Die Entstehung eines Organismus ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Zelltypen, die proliferieren und sich neu organisieren, bis sie schließlich ein ausgewachsenes Lebewesen bilden. Dieser Prozess wird von biochemischen und genetischen Faktoren gesteuert, deren Erforschung umfangreich betrieben wird. Der Einfluss dieser Faktoren macht sich unter anderem in einer Änderung der Zellmorphologie bemerkbar, die entweder durch die Zellen selbst oder durch Kräfte, die aufgrund der Umgebungsbeschaffenheit auf die Zellen einwirken, ausgelöst wird. Die Quantifizierung der Dynamik typischer Zellformen auch über verschieden Bereiche einer Zellkultur hinweg würde unser Verständnis von normaler und anormaler Gewebsmorphologie beträchtlich verbessern, was sowohl essentiell für die Diagnostik wäre als auch tiefere Einblicke in die dem Gewebewachstum zugrundeliegenden Mechanismen geben würde. Die Entstehung von Gewebe wird durch komplexe Wechselwirkungen von passiven und aktiven Faktoren gesteuert. Unter passiven Faktoren wird vor allem die mechanische Antwort der Zellen auf externe Kräfte verstanden, während unter aktiven Faktoren alle energieverbrauchenden biochemischen Prozesse zusammengefasst sind, die direkt oder indirekt Einfluss auf die Morphologie nehmen, wie beispielsweise die Entstehung eines Actomyosin-Komplexes. Das Aufdecken von Unterschieden zwischen aktiven und passiven Antworten reicht weit über die reine Biologie hinaus in den Bereich der Biophysik hinein, die sich unter anderem mit der Erforschung aktiver Materie befasst. Dementsprechend liegt der Schwerpunkt dieser Dissertation auf der Charakterisierung von Gewebsmorphologie auf verschieden Längenskalen, um dadurch wichtige Grenzen und physikalische Regeln zu identifizieren, die das Gewebewachstum beeinflussen. Als Modellsystem haben wir dabei unbeschränktes MDCK-II Epithelgewebe verwendet, das wir auf unterschiedlich harten Substraten wachsen ließen. Die Dissertation ist in fünf Kapitel gegliedert, wovon das erste eine allgemeine Einführung in das Thema gibt, angefangen mit in-vivo und in-vitro Modellen für Gewebewachstum, über das kollektive Verhalten von Zellen bis hin zu mechanischen Zelleigenschaften. Im zweiten Kapitel wird analysiert, wie Epithelzellen den vorhandenen Platz unter sich aufteilen. Vor fast 40 Jahren wurde vorgeschlagen, dass die räumliche Aufteilung der Zellen eines Epithels mit einer Voronoi-Tesselierung vergleichbar ist. Basierend auf diesem Ergebnis wurde in vielen aktuellen Studien die Zellmorphologie mit Hilfe einer Voronoi-Tesselierung ausgehend von den Schwerpunkten der Zellkerne untersucht. Der Fehler dieser Näherung wurde allerdings bisher nie quantifiziert. Unsere Studie quantifiziert erstmals den Fehler einer solchen Approximation im Hinblick auf die verschiedenen morphologischen Größen der Zellen. Zusätzlich haben wir eine neue und systematisch genauere Methode zur Rekonstruktion von Zellmembranen aus der Position der Zellkerne entwickelt. Zur Erstellung dieser neuen Voronoi-Tesselierung verwenden wir die äußeren Grenzen der Zellkerne. Der Erfolg dieser Tesselierung begründet sich in der engen Beziehung zwischen der Form der Zellkerne und der Form der gesamten Zelle innerhalb biologisch relevanter Zeitskalen. Da Zellkerne einfacher angefärbt und segmentiert werden können als Zellmembranen, kann diese einfach zu implementierende Methode umfangreich genutzt werden und den Weg für weitere morphologische Analysen von biologischem Gewebe ebnen. Da die Methode jedoch auf der präzisen Segmentierung der Zellkerne beruht, haben wir zusätzlich eine neue Methode zur Segmentierung von MDCK-II Zellkernen entwickelt und beschrieben. Im dritten Kapitel charakterisieren wir große MDCK-II Kolonien auf Glassubstraten und Polyacrylamidgelen (PA) mit verschiedenen Steifigkeiten. Die Mechanosensivität von Zellen wurde wiederholt für Einzelzellen bestätigt, wobei die Sensitivität für die Substratsteifigkeit für im Verband befindliche Zellen in Frage gestellt wird. Wir zeigen, dass - im Gegensatz zur aktuellen wissenschaftlichen Meinung - Zellen in großen Kolonien immer noch mechanosensitiv sind. Der Beweis dafür zeigt sich beim Wachstum auf sehr weichen Substraten oder – im Falle von härteren Substraten – bei längerer Beobachtung. Auf weichen Substraten konnten wir ein Wachstumsregime beobachten, welches bisher noch nicht beschrieben wurde. Dieses neue Wachstumsregime beginnt mit einem Archipel von dreidimensionalen Zelltropfen, die, sobald sie eine kritische Größe erreicht haben, einen Zellmonolayer mit einer sehr hohen und konstanten Zelldichte bilden. Dieser Monolayer ist umgeben von einem dreidimensionalen Rand von unorganisierten und immer noch proliferierenden Zellen. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen auf harten Substraten das bereits untersuchte Wachstumsverhalten von MDCK II. Um dieses Regime weiter quantifizieren zu können, legen wir den Fokus auf die morphologische Charakterisierung von runden zweidimensionalen Zellkolonien mir einer anfänglich einheitlichen und niedrigen Zelldichte. Diese Zellkolonien wachsen, verdichten sich und spalten sich in zwei Regionen auf, in ein Inneres und einen umgebenden Rand. Im Inneren unterliegen die Zellen einer Kontakthemmung, während der Rand der Kolonie, in dem die Zelldichte schrittweise abnimmt, aus sich bewegenden und proliferierenden Zellen besteht. Auch der Vergleich zwischen den Zellkolonien auf harten Gelen mit denen auf Glassubstraten zeigt Unterschiede in der Dichteverteilung der Zellen und der Größe der Zellkolonie. So wird der Gleichgewichtszustand auf harten Gelen immer bei höheren Dichten erreicht als auf Glassubstraten. Diese Auswirkungen sind eine Folge der unterschiedlichen Proliferationsraten. Wir haben herausgefunden, dass große Zellen stärker auf harten Gelen als auf Glassubstraten proliferieren. Zudem sind sowohl Art als auch Anzahl der Unregelmäßigkeiten, welche in der Monolayerstruktur über die Zeit hinweg zutage treten, auf Glassubstraten sehr unterschiedlich. Die Resultate der in-vitro Studien deuten auf eine vielschichtige Antwort von vollständig differenzierten Zellen auf die Steifigkeit ihrer Umgebung hin. Die Charakterisierung des Wachstums von unbegrenzten runden Epithel-Kolonien liefert Beweise für eine spontane langreichweitige Kompartimentierung in ein Inneres und einen umgebenden Rand. Im vierten Kapitel berichten wir von unseren Untersuchungen zu den notwendigen Bedingungen für die Entstehung der Kompartimentierung. Als Erstes haben wir die Geschwindigkeit der Zellen als Funktion des radialen Abstands der Zellen zum Zentrum des Clusters gemessen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Geschwindigkeit der Zellen in der Randregion linear von der Zellposition im Cluster abhängt, während sie im Inneren konstant ist. Mithilfe unserer Simulation konnten wir erfolgreich die Morphologie der Cluster über einen Zeitraum von acht Tagen reproduzieren. Dadurch wurde bestätigt, dass die Messungen der Zell-Geschwindigkeit, das Wachstum der Clusterfläche über die Zeit hinweg und die Wahrscheinlichkeit der Proliferation mit der spontanen Kompartimentierung der Zellkolonien übereinstimmen. Des Weiteren haben wir die Simulationen als Werkzeug genutzt, um zu testen, wie sich unterschiedliches Zellverhalten auf die globale Morphologie der Zellcluster auswirkt. Entscheidend ist hierbei, dass unsere experimentellen Daten den aktuellen Wissensstand über kollektives Zellverhalten und Proliferation erweitern. Während des Wachstums einer Zellkolonie organisieren sich die Zellen gemeinsam mit ihren nächsten Nachbarn und ändern dementsprechend ihre Form. Die Bewegung und Restrukturierung erfolgt so lange, bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist. Im letzten Kapitel untersuchen wir den Einfluss der Dichte auf die Änderungen der Zellform. Wir zeigen, dass sich die meisten morphologischen Größen mit der Zelldichte ändern, obwohl deren Werte nicht von der Zellfläche abhängen. Jedoch weisen die Zellen, unabhängig von der Zelldichte im Gleichgewichtszustand, die gleichen morphologischen Eigenschaften auf. Dieses Ergebnis impliziert, dass der Gleichgewichtszustand durch die morphologische Organisation definiert wird und nicht, wie bisher angenommen, durch die Zelldichte. Außerdem haben wir die Ähnlichkeiten zwischen der Organisation von Epithelgewebe und zufälliger Packung von Ellipsen untersucht. Da die Zellkerne eine höhere Steifigkeit haben als das Zytoplasma, nehmen sie, wenn sich das Gewebe verdichtet, zunehmend mehr von der totalen Zellfläche ein. Folglich ist das Verhältnis der Flächen der Zellkerne zur Fläche der gesamten Zelle der Flächenpackungsanteil. Dieses Phänomen erlaubt das direkte Zuordnen von Zelldichte und Flächenanteil zur zufälligen Packung. Wir haben deshalb Bilder von Zellmonolayern, die den ganzen Bereich der möglichen Zelldichten abdecken, mit zufälligen Packungen von monodispersen und polydispersen Ellipsen verglichen. Die polydispersen Ellipsen haben die gleichen Flächen und Elongationen wie die Zellkerne des gegebenen Bildes. Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen offenbaren eine unvorhergesehene Ähnlichkeit zwischen der zufälligen Packung von Zellkernen und echtem Gewebe; am offensichtlichsten ist das für Gewebe im Gleichgewichtszustand. Zusätzlich bekräftigen Korrelationsfunktionen, dass die Reorganisierung der Zellen, welche mit dem Anstieg der Zelldichte einhergeht, eine notwendige Konsequenz des ansteigenden Flächenanteils ist (dies ergibt sich aus der relativen Steifigkeit der Zellkerne). Dennoch bleiben manche Größen im Gewebe unverändert. Das deutet auf einen aktiven Zellmechanismus hin, der diese Größen währ-end des Verdichtens des Gewebes konstant hält. Wir haben viele wichtige Prinzipien identifiziert, die die Organisation von Gewebe auf verschiedenen Längenskalen regulieren. Die Werkzeuge zur Bildanalyse, die wir im Rahmen dieser Arbeit entwickelt haben, sind von hoher wissenschaftlicher Relevanz, u.a. auch im Rahmen der Diagnostik. Weiterhin deutet unsere Arbeit auf die Existenz biologischer Phänomene hin, die bis dato noch nicht ausreichend untersucht wurden. Zunächst wurde die schnelle formbezogene Kopplung zwischen Zellkern und Membran identifiziert. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Zellen auch im Gewebeverband die Steifigkeit des Substrats wahrnehmen und darauf in einer komplexen Art und Weise reagieren. Die langreichweitige Organisation der Zellen, die wir durch unsere Experimente aufdecken konnten, enthält eine Fülle von nicht vollkommen verstandenen Mechanismen des kollektiven und individuellen Zellverhaltens, zu deren Erforschung wir einen Beitrag leisten konnten. Zusätzlich haben wir eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen den morphologischen Eigenschaften des Epithels und der zufälligen Packung von Ellipsen entdeckt, was zu neuen Erkenntnissen über die zelluläre Organisation führt. All diese Phänomene eröffnen einen neuen Blickwinkel auf die Gesetze, die die Gewebebildung steuern. Es sind allerdings weiterführende Studien notwendig, um die vorgestellten Ergebnisse weiter zu vertiefen und neue Gesetze hinter den faszinierenden Prozessen von Gewebswachstum und -organisation aufzudecken.

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