Design of an allosterically controlled serpin-based drug shuttle for the delivery of doxycycline and doxorubicin

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2018-08-27
Issue Year
2018
Authors
Schmidt, Karin
Editor
Abstract

Over the last decades huge efforts have been made in generating shuttle systems for the delivery of drugs to diseased cells in order to improve drug efficacy and bioavailability and to minimize side effects substantially. However, most of these drug delivery systems failed in clinical trials due to undesirable immunotoxicity. This thesis addresses the redesign of a human plasma protein for the transport and delivery of therapeutic relevant agents by engineering ligand-binding pockets and an allosteric release mechanism at target sites. The design of new ligand-binding pockets into an existing protein scaffold is a field with some success stories but still remains challenging, while the allosteric coupling of two functional sites is even more demanding. Here, program MUMBO was used to predict amino acid substitutions necessary for the design of a doxycycline- and a doxorubicin-binding pocket on the backbone of α1-antichymotrypsin (ACT), which is a prototypical member of the serine protease inhibitor (serpin) superfamily. Ligand affinities were allosterically coupled to the serpin-typical stressed-to-relaxed (S-to-R) transition following proteolytic cleavage of the reactive center loop (RCL). Furthermore, the drug delivery proteins were engineered to undergo the S-to-R transition upon RCL cleavage by proteases, which are elevated at tumor cells in order to ensure a targeted delivery. The inhibitory ACT, which is unable to bind any ligand on top of β-sheet B in its wild type context, was designed to bind cortisol by mimicking steroid binding to the non-inhibitory serpin corticosteroid-binding globulin (CBG) by transferring twelve amino acids from CBG to ACT in a previous study. MUMBO based redesign of the steroid-binding pocket enabled the engineering of doxycycline- and doxorubicin-binding pockets on the ACT scaffold. The most important pocket feature is the designed ligand clamp, comprised by residues Trp386 and Phe277, which stacks the aromatic rings of doxycycline and doxorubicin. The designed binding pockets possess some ligand specificities and affinities in the low micro-molar range as determined by ITC measurements. The targeted drug release was generated by introducing specific sequence motifs into the RCL, which can preferably be recognized and cleaved by matrix metalloproteinases (MMPs), as MMPs are elevated at cancer cells to degrade the extracellular matrix (ECM) for metastasis. The cleavage progress as well as the maintained ability to undergo the S-to-R transition were demonstrated for the MMP9- and MMP14-cleavable drug delivery serpins (DDS) by SDS-PAGE, CD measurements and X-ray crystallography. In order to induce a boosted ligand release, substitutions in the RCL hinge region were tested for allosterically coupling the RCL insertion to the binding pocket. Indeed, the substitution of the highly conserved alanine at P12 for an arginine caused a tenfold reduction in binding affinity upon S-to-R transition for the doxycycline- and doxorubicin-DDS and a remarkable 220-fold affinity reduction in context of the steroid-DDS as determined in ITC experiments. Crystal structures of cleaved DDS variants holding P12 arginine revealed a closed binding pocket conformation caused by shifted and unshifted pocket elements, resulting in a narrowed pocket volume and ligand release. In summary, the combination of ligand-binding pockets and RCL cleavage motifs gave a large variety of DDS constructs and further redesign for diverse ligands or protease baits is almost unlimited. The proof of concept study presented here demonstrates the feasibility for engineering human ACT into a drug delivery serpin, which is most likely to be compatible with the human immune system.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten wurde intensiv an der Entwicklung von Medikamententransportern geforscht, um sowohl die Effizienz und Bioverfügbarkeit der Medikamente zu verbessern als auch Nebenwirkungen zu minimieren. Allerdings scheitern die meisten dieser Transportsysteme in klinischen Studien anhand unerwünschter Immuntoxizität. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Umwandlung eines humanen Plasmaproteins in ein Transportprotein für die Zustellung von Therapeutika an Zielorte, indem Ligandenbindetaschen und ein allosterisch gekoppelter Freisetzungsmechanismus konstruiert wurden. Das Design neuer Bindetaschen in ein vorhandenes Proteingerüst ist ein anspruchsvolles Feld mit wenigen bereits verzeichneten Erfolgen, während eine allosterische Kopplung zweier funktioneller Seiten zusätzlich herausfordernd ist. In dieser Arbeit wurde das Programm MUMBO zur Vorhersage nötiger Aminosäureaustausche für das Design von Doxycyclin- und Doxorubicin-Bindetaschen auf dem Grundgerüst von α1-Anti-chymotrypsin (ACT) herangezogen, welches ein prototypisches Mitglied der Serinprotease-Inhibitor (Serpin) Superfamilie ist. Die Ligandenaffinitäten wurden allosterisch an den für Serpine typischen stressed-to-relaxed (S-to-R) Übergang gekoppelt, welcher durch den proteolytischen Schnitt des reactive center loops (RCL) initiiert wird. Des Weiteren wurden die Transportproteine so modifiziert, dass die S-to-R Umlagerung durch an Tumorzellen angereicherte Proteasen eingeleitet wird, um eine gezielte Medikamentenfreisetzung zu gewährleisten. Das inhibitorische Serpin ACT wurde in einer vorherigen Studie in ein cortisolbindendes ACT umfunktioniert, indem bis zu zwölf Aminosäurereste von dem nicht-inhibitorischen Serpin Corticosteroid-bindendes Globulin (CBG) auf das ACT übertragen wurden. Mittels MUMBO Berechnungen wurde diese artifizielle Steroidbindetasche für Doxycyclin und Doxorubicin neu modelliert und Affinitäten im mikromolaren Bereich erzielt. Ein wichtiges Merkmal der designten Bindetaschen ist eine hydrophobe Klammer bestehend aus Trp386 und Phe277, welche die aromatischen Ringe von Doxycyclin und Doxorubicin in der Bindetasche packt. Das Einbringen von proteasespezifischen Sequenzmotiven in den RCL ergab Transportproteine, welche von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) erkannt und geschnitten werden, da MMPs vermehrt von metastasierenden Krebszellen zur Degradierung der extrazellulären Matrix (ECM) sezerniert werden. Der Schnittprozess und die beibehaltene Fähigkeit des S-to-R Übergangs wurde für die MMP9 und MMP14 sensitiven drug delivery serpins (DDS) mittels SDS-PAGE, CD Messungen und Röntgenstrukturanalyse bewiesen. Um die Freisetzungseffizienz nach der S-to-R Umlagerung zu verstärken, wurden Aminosäureaustausche im RCL hinge getestet, welche die RCL Insertion mit der Bindetasche allosterisch koppeln. Der Austausch des konservierten Alanin an P12 zu einem Arginin verursachte einen zehnfachen Affinitätsverlust für doxycyclin- und doxorubicinbindende DDSs und einen bemerkenswerten 220-fachen Affinitätsverlust für das steroidbindende DDS. Kristallstrukturen der geschnittenen DDS Konstrukte mit mutiertem P12 Arginin offenbarten eine geschlossene Konformation der Bindetaschen, welche durch verlagerte Bindetaschenelemente verursacht wurde, sodass das Taschenvolumen reduziert und die Liganden freigesetzt wurden. Die Kombination verschiedener Bindetaschen und RCL Motive ergibt eine große Vielfalt an DDS Konstrukten, welche für diverse Liganden und Proteasen erweitert werden kann. Somit konnte gezeigt werden, dass das humane ACT in ein Transportprotein umfunktioniert werden kann, welches höchstwahrscheinlich mit dem humanen Immunsystem kompatibel ist.

DOI
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