Entwicklung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln als Radiokatalysatoren in der Strahlentherapie

Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
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Sommer, Anja Nicole

The interest in the continuous development of nanotechnology is unabated and the application of nanoparticles in almost any area of everyday life is indispensable. Magnetic iron oxide nanoparticles and especially superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) have attracted the interest of researchers worldwide. These nanoparticles exhibit excellent electrical, electrochemical, mechanical, optical and magnetic properties. In particular, the superparamagnetic properties ensure the potential in various applications of these SPIONs. For the successful implementation of SPIONs in numerous fields it is important to improve and explore the synthetic and stabilization strategies continuously. The biocompatibility of the SPIONs is of great interest, especially in the medical and biotechnological field. As a consequence, nowadays SPIONs are already used in various therapeutic and diagnostic procedures. Since cancer is a leading cause of death, it is still important to continue the research for new treatment methods in this field. The development of radiation therapy, which is a pillar of tumor therapy, is supposed to substantially increase the chances of a recovery for cancer patients. Due to the use of radio-sensitizers or radio-catalysts, the sensitivity of tumor tissues to x-ray radiation will be increased dramatically, resulting in lower radiation doses required for therapy, which reduces painful side effects. This can be achieved by the use of SPIONs due to their ability to generate cytotoxic ROS via Fenton and/or Haber-Weiss reaction. In this work, two synthetic methods were used preparing SPIONs, according to the principles of green chemistry. In addition to the established alkaline co-precipitation according to Massart et al., an improved method by Qu et al. was used. Using the first one, the LT-SPIONs are produced in an inert atmosphere from aqueous iron chloride solutions by adding NH4OH. The synthesis is followed by several washing steps, which may cause partial oxidation of the sensitive SPION surfaces, because the stabilization by carboxylic acids is carried out afterwards. To improve the protection of the SPION surfaces against oxidation, and their stability in water, short chain carboxylic acids were used to passivate the SPION surfaces. Due to the attachment of citric acid, DL-tartaric acid, DL-malic acid and gluconic acid excellent stable surfaces can be generated. These carboxylic acids were used as being non-toxic, well soluble in water, and small, minimizing the hydrodynamic diameter of stabilized SPIONs. To prevent a broad size distribution and the partial oxidation of the surfaces during the classical co-precipitation, the method according to Qu et al. was applied. Here, the HT-SPIONs are precipitated in a one-pot synthesis of the iron chlorides dissolved in diethylene glycol (DEG) by adding NaOH at high temperatures in an inert atmosphere. The particle formation is followed by a ligand exchange of the original DEG shell against carboxylic acids during the cooling process. These stabilized HT-SPIONs could be easily transferred into water and possess the same excellent stability as the stabilized LT-SPIONs. The size distribution, morphology and composition as well as the magnetic behavior and the surface properties of the as synthesized LT- and HT-SPIONs was fully examined. The spherical and ellipsoid LT-SPIONs have a broad size distribution and a mean diameter of about 13 nm. In contrast, the roughly spherical HT-SPIONs possess a narrow size distribution with diameters of about 5 nm. The HRTEM and XRD results showed that both, the LT- and HT-SPIONs were single crystalline. XRD and XPS measurements could further prove that LT-SPIONs consist of a mixture of magnetite and maghemite, with maghemite as main component. This can be explained by the additional purification steps prior to stabilization and due to insufficient protection of the surface against oxidation. Magnetite is the main component of the HT-SPIONs, which is favored by the one-pot synthesis and the steady protection of the surface. The results of SQUID measurements confirmed the superparamagnetism of both, uncoated and coated LT- and HT-SPIONs. The proof of a successful addition of stabilizing agents is provided by the shift of the carbonyl band in the FTIR studies. In the second part of the thesis the nanomedical application of the LT- and HT-SPIONs was examined. Studies of nanotoxicology by the use of thiazolyl blue and trypan blue staining revealed a good biocompatibility of carboxylic acid coated SPIONs. The cellular uptake of the differently coated SPIONs and the intracellular distribution in the MCF7 cells was examined using TEM. A significant difference could be observed for citrate-stabilized and uncoated LT-SPIONs. Whereas the uncoated LT-SPIONs could be found encapsulated in vesicles in the MCF7 cells, the citric acid stabilized LT-SPIONs were homogenously distributed in the cytoplasm. This suggests that the stabilizing ligands facilitate the membrane crossing of SPIONs and thereupon, promote an efficient interaction with the cells and participation in cellular reactions. A similar behavior was observed for HT-SPIONs. The DEG-coated HT-SPIONs could be found in vesicles and in the cytoplasm. The citrate-coated HT-SPIONs exhibit an identical behavior as in the case of LT-SPIONs. The cellular uptake of SPIONs occurs via endocytosis, as indicated by the pseudopodia, which are built from the cell membrane towards the SPIONs. For a possible application of SPIONs in radiation therapy, the intracellular ROS formation due to internalized SPIONs was studied using the DCFH-DA-assay. The uncoated and coated LT-SPIONs in non-irradiated cells only cause a slight increase in cellular ROS concentration. Due to irradiation of MCF7 cells incubated with LT-SPIONs with a single dose of 3 Gy, a dramatic increase in intracellular ROS level could be detected. The best results could be obtained for internalized citrate- and DL-malate-coated LT-SPIONs. The former sample additionally exhibits a very low non-irradiated ROS level making them a promising candidate as radio-catalysts for radiation therapy. By irradiation, for the internalized DEG- and carboxylic acid-coated HT-SPIONs an increased ROS concentration could be detected as well. The former, in the non-irradiated state led in to a very strong increase in the intracellular ROS level. For carboxylic acid-coated HT-SPIONs elevated ROS concentrations could be detected for non-irradiated cells. As a result of irradiation, a strong increase in the intracellular ROS level was detected for the citrate-coated HT-SPIONs. To understand the increase in ROS concentration in MCF7 cells due to internalized SPIONs, the tumor cells were incubated with Fe2+ and Fe3+ solutions. It could be exhibited, that resulting ROS values are in case of SPIONs exceeded by a multiple. This can be explained by the catalytic effect of SPION surfaces. The effect of X-ray radiation on surface structures of SPIONs was examined using XANES and EXAFS. The X-rays led to the formation of new geometries and oxidation states of superficial iron ions. By interaction with X-rays the stabilizing hydroxyl, water, DEG and carboxylic acid groups were completely or partially removed for the surfaces of SPIONs, whereby the Fe2+ ions can by oxidized. This explains the increased intracellular ROS concentration caused by internalized SPIONs in irradiated cells due to their reactive surfaces. These reactive surfaces are supposed to catalyze the intracellular Fenton and/or Haber-Weiss reaction. In summary, a significant improvement in radiation therapy can be achieved with these biocompatible LT and HT-SPIONs (uncoated, DEG-coated and carboxylic acid-coated). The SPIONs can be produced easily and cheaply with good yields and qualities by the selected synthetic methods. Due to their outstanding properties, SPIONs have a wide ranging field of applications. Especially in biomedical applications they are of great interest, due to their excellent biocompatibility. They are easily taken up by tumor cells and can be guided by an external magnetic field. Furthermore, their superparamagnetic properties allow them to be accumulated in a therapeutic region. The most significant benefit is the application of considerably lower doses of X-radiation which are necessary to achieve good results in intracellular ROS concentration. These abilities of SPIONs in combination with their superparamagnetic behavior can revolutionize modern radiation therapy.


Das Interesse an der steten Weiterentwicklung der Nanotechnologie ist ungebrochen und die Anwendung von Nanopartikeln ist in kaum einem Bereich des alltäglichen Lebens mehr wegzudenken. Magnetische Eisenoxidpartikel und besonderes superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) haben das Forschungsinteresse geweckt. Diese Nanopartikel zeichnen sich durch herausragende elektrische, elektrochemische, mechanische, optische und magnetischen Eigenschaften aus. Insbesondere die superparamagnetischen Eigenschaften sorgen für das mannigfaltige Einsatzpotential der SPIONs. Für die erfolgreiche Nutzung der SPIONs in den zahlreichen Einsatzgebieten gilt es, die Synthesemethoden und Stabilisierungsstrategien kontinuierlich zu verbessern und zu erforschen. Speziell auf dem medizinischen und biotechnologischen Gebiet sind die bioverträglichen SPIONs von Interesse und finden bereits Einsatz in diversen Therapie- und Diagnoseverfahren. Da Krebs eine der Haupttodesursachen ist, gilt es auch weiterhin, die Forschung für neue Therapiemethoden auf diesem Gebiet weiter voranzutreiben. Die Weiterentwicklung der Strahlentherapie, einer Säule der Tumortherapie, sollte die Heilungschancen von Krebspatienten erheblich steigern. Durch den Einsatz von Radiosensibilisatoren oder Radiokatalysatoren wird die Empfindlichkeit des Tumorgewebes gegenüber Strahlung erhöht werden, wodurch geringere Strahlendosen notwendig sind und die schmerzhaften Nebenwirkungen reduziert werden können. Das kann durch die Verwendung von SPIONs und deren Fähigkeit zur Generierung von zytotoxischen ROS mittels der Fenton- und/oder Haber-Weiss-Reaktion erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit fanden zwei Syntheseverfahren zur Herstellung der SPIONs Anwendung, die den Prinzipien der grünen Chemie folgen. Neben der klassischen alkalischen Mitfällung nach Massart et al., kam auch eine Verbesserung dieser Methode nach Qu et al. zum Einsatz. Durch die erstgenannte Methode werden die LT-SPIONs in einer Inertgasatmosphäre aus wässriger Eisenchloridlösungen durch Zugabe von NH4OH hergestellt. Der Synthese folgen mehrere Waschschritte, durch die die empfindlichen SPION-Oberflächen partiell oxidieren können, da die Stabilisierung durch die Carbonsäuren erst im Anschluss erfolgt. Um die Oberflächen besser gegen Oxidation zu schützen und die Stabilität der SPIONs in Wasser zu verbessern werden kurzkettige Carbonsäuren zur Passivierung der Oberfläche eingesetzt. Durch die Anbindung von Zitronensäure, DL-Weinsäure, DL-Äpfelsäure und Gluconsäure können hervorragend stabile Oberflächen erzeugt werden. Diese Carbonsäuren wurden verwendet, da sie nicht toxisch, gut in Wasser löslich und klein sind und damit den hydrodynamischen Durchmesser der SPIONs gering halten. Eine zu breite Größenverteilung und die partielle Oxidation der Oberflächen während der klassischen Mitfällung wird vermieden, wenn die Methode nach Qu et al. angewendet wird. Dabei werden in einer Eintopfsynthese unter Inertgasatmosphäre die HT-SPIONs aus den in Diethylenglykol (DEG) gelösten Eisenchloriden durch Zugaben von NaOH bei hohen Temperaturen gefällt. Der Bildungsreaktion folgt während des Abkühlprozesses ein Ligandenaustausch der ursprünglichen DEG-Hülle gegen die Carbonsäuren. Die so stabilisierten HT-SPIONs können einfach in Wasser überführt werden und besitzen wie die stabilisierten LT-SPIONs eine exzellente Stabilität. Die Größenverteilung, Morphologie und Zusammensetzung sowie das magnetische Verhalten und die Oberflächenbeschaffenheit der synthetisierten LT- und HT-SPIONs wurde vollständig charakterisiert. Die sphärischen bis ellipsoiden LT-SPIONs haben eine breite Größenverteilung und einen mittleren Durchmesser von etwa 13 nm. Im Gegensatz dazu konnten für die annähernd sphärischen HT-SPIONs engere Größenverteilungen mit Größen um 5 nm erhalten werden. Die HRTEM- und XRD-Untersuchungsergebnisse zeigte, dass sowohl die LT- als auch die HT-SPIONs einkristalline sind. Mit XRD- und XPS-Messungen konnte gezeigt werden, dass die LT-SPIONs aus einer Mischung aus Magnetit und Maghemit bestehen, wobei Maghemit die dominante Phase ist. Das resultiert aus dem zusätzlichen Aufreinigungsschritt vor der Stabilisierung und dem ungenügenden Schutz der Oberflächen vor Oxidation. Bei den HT-SPIONs hingegen ist Magnetit die Hauptkomponente, was durch die Eintopfsynthese und den steten Schutz der SPION-Oberflächen begünstigt wird. Die Ergebnisse aus den SQUID-Untersuchungen bestätigten den Superparamagnetismus der nicht-stabilisierten sowie stabilisierten LT- und HT-SPIONs. Der Nachweis der erfolgreichen Anbindung der stabilisierenden Carbonsäuren wurde durch die Verschiebung der Carbonylbande mittels FTIR-Untersuchungen erbracht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die nanomedizinische Einsatzbefähigung der LT- und HT-SPIONs untersucht. Untersuchen zur Nanotoxikologie mittels Thiazolylblau- und Trypanblaufärbung ergaben, dass die Carbonsäure-stabilisierten SPIONs über eine gute Biokompatibilität verfügen. Der Aufnahmemechanismus der unterschiedlich oberflächenbehandelten SPIONs in die MCF-Zellen und ihre intrazelluläre Verteilung wurde mittels TEM-Aufnahmen untersucht. Es konnte ein deutlicher Unterschied durch die Stabilisierung mit der Zitronensäure im Vergleich zu den nicht-stabilisierten LT-SPIONs beobachtet werden. Während die nicht-stabilisierten LT-SPIONs in Vesikeln in den MCF7-Zellen vorliegen, liegen die Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs homogen verteilt im Zytoplasma vor. Das lässt darauf schließen, dass die Liganden zur Stabilisierung den Membrandurchtritt begünstigen und die stabilisierten LT-SPIONs effizienter mit den Zellen wechselwirken können und an intrazellulären Reaktionen beteiligt werden. Ein ähnliches Verhalten wurde für die HT-SPIONs beobachtet. Die DEG-stabilisierten HT-SPIONs liegen in Vesikeln und im Zytoplasma vor. Die Zitronensäurestabilisierung der HT-SPIONs führte zum identischen Verhalten wie im Fall der LT-SPIONs. Die zelluläre Aufnahme der SPIONs erfolgt über Endozytose, da sich Pseudopodien von der Zellmembran in Richtung der SPIONs ausbilden. Für eine mögliche Anwendung der SPIONs in der Strahlentherapie wurde die ROS-Konzentrationserhöhung durch die intrazellulären SPIONs untersucht. Dafür wurde der DCFH-DA-Assay durchgeführt. Die nicht-stabilisierte und stabilisiert LT-SPIONs bewirkten in unbestrahlten Zellen nur einen geringen Anstieg der intrazellulären ROS-Konzentration. Infolge der Bestrahlung mit 3 Gy der mit LT-SPIONs inkubierten MCF7-Zellen wurde meist ein drastischer Anstieg des intrazellulären ROS-Niveaus gemessen. Die besten Ergebnisse konnten für die Zitronensäure- und DL-Äpfelsäure-stabilisierten LT-SPIONs erhalten werden. Hierbei zeigten die erstgenannten ein ausgesprochen niedriges ROS-Niveau vor der Bestrahlung, was sie zu vielversprechenden Radiokatalysatoren für die Strahlentherapie macht. Bei den DEG- und Carbonsäure-stabilisierten HT-SPIONs konnte ebenfalls eine Erhöhung der ROS-Konzentration durch die Bestrahlung beobachtet werden. Die DEG-Stabilisation führte auch im unbestrahlten Zustand zu einer sehr starken Erhöhung des intrazellulären ROS-Levels. Auch für die Carbonsäure-stabilisierten HT-SPIONs konnten vor der Bestrahlung einige stark erhöhte Werte der ROS-Konzentration ermittelt werden. Infolge der Bestrahlung wurde für die Zitronensäure-stabilisierten HT-SPIONs eine starke Steigerung des intrazellulären ROS-Niveaus ermittelt. Für ein Verständnis der ROS-Konzentrationserhöhung in den MCF7-Zellen durch die SPIONs wurden die Tumorzellen mit Fe2+- und Fe3+-Lösungen inkubiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die erhaltenen ROS-Werte um ein Vielfaches von den SPIONs übertroffen werden. Das wird mit der katalytischen Wirkung der SPION-Oberflächen erklärt. Der Einfluss der Röntgenbestrahlung auf die Oberflächenstrukturen der SPIONs wurde mit XANES und EXAFS untersucht. Die Röntgenstrahlung führte zur Bildung von neuen Geometrien und Oxidationszustände der oberflächenständigen Eisenionen. Durch die Wechselwirkung mit der Röntgenstrahlung werden die stabilisierenden Hydroxyl-, Wasser-, DEG- und Carbonsäuregruppen ganz oder teilweise von der SPIONs-Oberfläche abgetragen, wodurch die Eisenionen oxidieren können. Damit kann erklärt werden, dass die intrazelluläre ROS-Konzentrationserhöhung in den mit SPIONs inkubierten und bestrahlten Zellen durch die reaktiven Oberflächen hervorgerufen wird. Diese reaktiven SPION-Oberflächen katalysieren die intrazellulär ablaufenden Fenton- und/oder Haber-Weiss-Reaktion. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit diesen biokompatiblen LT- und HT-SPIONs (nicht-stabilisiert, DEG- und Carbonsäure-stabilisiert) eine drastische Verbesserung der Strahlentherapie erzielt werden kann. Die SPIONs sind aufgrund der gewählten Syntheseverfahren einfach und kostengünstig in guten Ausbeuten und Qualitäten zuverlässig herzustellen. Durch ihre herausragenden Eigenschaften verfügen sie über ein weitreichendes Anwendungsspektrum. Aber besonders in biomedizinischen Bereichen sind SPIONs aufgrund ihrer exzellenten Bioverträglichkeit von Interesse. Sie werden sehr gut und schnell von Tumorzellen aufgenommen und können zusätzlich durch ihren superparamagnetischen Charakter mit externen Magnetfeldern bewegt und in entsprechenden Regionen des Körpers angereichert werden. Darüber hinaus lassen sich dort mit deutlich geringeren Strahlendosen sehr gute Ergebnisse in der Erhöhung der intrazellulären ROS-Konzentration erzielen. Diese Fähigkeit, gepaart mit dem superparamagnetischen Verhalten, kann die moderne Strahlentherapie revolutionieren.

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