Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies directed against SARS-CoV-2

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2023-02-06
Issue Year
2023
Authors
Peter, Antonia Sophia
Editor
Abstract

The generation and production of highly efficient therapeutic agents directed against the severe acute respiratory syndrome Coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) was of utmost importance since its emergence in late 2019. This virus has quickly spread globally causing the current Coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. The development of monoclonal neutralizing antibodies against this virus is a straightforward option for the treatment of SARS-CoV-2 infections. For the rapid generation of these, mice carrying the entire set of human immunoglobulin V region gene segments are a powerful tool. By priming these mice with SARS‐CoV‐2 Spike encoding DNA and boosting with the Spike protein we were able to identify and isolate 29 antibodies, designated TRES antibodies, that bind to the SARS-CoV-2 Spike protein. Of these nine neutralize the virus with IC50s within the ng/ml range. In ELISA binding studies and through DNA sequence analyses it could be confirmed that three of these nine antibodies are clonally related and target the Spike receptor binding domain (RBD). They neutralize by directly blocking the RBD and cellular receptor human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) interaction. Hence, they are also able to compete for hACE2 binding. The remaining six neutralizing antibodies are also related and form a second cluster that interacts and binds to the N-terminal domain of the Spike protein. They do not compete for binding with the cellular receptor or antibodies of the first cluster. For better understanding of the genetic barrier escape mutants were selected in vitro to one antibody of each cluster and a combination of the two. The latter was difficult to select and only emerged after longer passages and higher inoculation volumes and led to the abrogation of Cluster 1 and 2 antibody binding and neutralization. Three independently generated escape variants to the RBD binding antibody harbored mutations at position T478 or S477. The mutations rendered Cluster 1 antibodies ineffective whilst Cluster 2 antibodies were still able to bind but showed a reduced neutralization activity. The mutations found in the escape variants to the NTD antibody conferred resistance to the NTD, but not to the RBD cluster antibodies. SARS-CoV-2 variants carrying the same mutations as the ones identified in the escape variants or in close proximity were also resistant to neutralization by the antibodies identified. The neutralizing activity of the antibodies was analyzed in two animal models. In a post- and preexposure prophylaxis study in human ACE2 transgenic mice it could be shown that TRES antibodies significantly reduced the viral load in the lung, brain, liver, spleen and bronchoalveolar lavage in comparison to an isotype control. Additional efficacy studies were performed in rhesus macaques. To this end, four macaques per group were treated with TRES6 or a neutralizing RBD binding monoclonal antibody GN1 or Palivizumab as a control. All macaques, except for two TRES6 treated animals, displayed reduced viral loads in secretions of the upper respiratory tract and bronchoalveolar lavages. It could be confirmed by sequencing of the viral isolates from the two TRES6 animals with high viral loads, that resistance mutations to this antibody had emerged as early as two days post exposition to the virus. Concluding we were able to identify antibodies’ that neutralize SARS-CoV-2 in vitro and in vivo confirming that mice transgenic for the human immunoglobulin repertoire are a powerful platform, in pandemic preparedness initiatives. We were furthermore able to underline the need for thorough investigation of escape mutations to select the most potent combination of monoclonal antibodies for clinical use. Lastly, we could determine that not only an antibodies IC50 but also its genetic resistance barrier should be considered when choosing antibodies for SARS-CoV-2 treatment.

Abstract

Die Entwicklung und Herstellung wirksamer Therapeutika gegen das schwere-akute- Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2 (SARS-CoV-2) ist seit seinem Auftreten Ende 2019 von größter Bedeutung. Dieses Virus ist der Auslöser der aktuellen Coronavirus-Krankheit-2019 (COVID-19) Pandemie und hat sich innerhalb kurzer Zeit weltweit verbreitet. Die Entwicklung von monoklonalen neutralisierenden Antikörpern, welche gegen dieses Virus gerichtet sind, ist eine gut erforschte Option für die Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen. Für die schnelle Entwicklung dieser Antikörper sind Mäuse, welche die gesamten Gensegmente der menschlichen Immunglobulin- V-Region tragen, eine Möglichkeit. Durch die Erstimmunisierung solcher Mäuse mit für SARS-CoV- 2 Spike codierender DNA und Auffrischungsimpfungen mit dem Spike-Protein konnten wir 29 Spike bindende Antikörper, so genannte TRES-Antikörper, identifizieren und isolieren. Neun dieser Antikörper neutralisieren das Virus mit IC50-Werten im ng/ml Bereich. In ELISA-Bindungsstudien und durch DNA-Sequenzanalysen konnte bestätigt werden, dass drei dieser neun Antikörper klonal verwandt sind und sich gegen die Spike Rezeptor-Binde-Domäne richten. Sie neutralisieren durch direkte Blockierung der Interaktion zwischen der Rezeptor-Binde-Domäne und dem zellulären Rezeptor human Angiotensin-Converting Enzyme 2 (hACE2). Daher können sie auch mit hACE2 um Bindung konkurrieren. Die anderen sechs neutralisierenden Antikörper sind ebenfalls verwandt und bilden ein zweites Cluster, welches mit der N-terminalen Domäne des Spike-Proteins interagiert. Diese Antikörper konkurrieren nicht um die Bindung mit dem zellulären Rezeptor. Zum besseren Verständnis der genetischen Barriere wurden in vitro Escape-Mutanten gegen einen Antikörper von jedem Cluster und einer Kombination der beiden generiert. Letztere Escape-Mutante trat erst nach langen Passagen und der Verdopplung der Inokulationsvolumina auf und führte zur Aufhebung der Antikörperbindung und Neutralisierung durch Cluster 1 und 2. Drei unabhängig voneinander erzeugte Escape-Varianten gegen den RBD-bindenden Antikörper wiesen Mutationen an den Positionen T478 oder S477 des Spike Proteins auf. Diese Mutationen machten die Cluster 1 Antikörper unwirksam, wohingegen die Cluster 2 Antikörper noch binden konnten, überraschenderweise aber eine verringerte Neutralisierungsaktivität aufwiesen. Mutationen, welche in den NTD resistenten Varianten gefunden wurden waren resistent gegen die Neutralisation durch Antikörper des NTD Clusters wohingegen die Antikörper des RBD Clusters weiterhin neutralisieren. SARS-CoV-2- Varianten, die dieselben Mutationen wie die in den Escape-Varianten oder in unmittelbarer Nähe davon aufweisen, waren ebenfalls neutralisationsresistent gegenüber den isolierten Antikörpern. Die neutralisierende Wirkung der Antikörper wurde außerdem in zwei Tiermodellen untersucht. In einer Post- und Präexpositions Prophylaxe Studie an Mäusen, welche transgen für hACE2 sind, konnte gezeigt werden, dass TRES-Antikörper die Viruslast in Lunge, Gehirn, Leber, Milz und Bronchoalveolärer Lavage im Vergleich zu einer Isotypkontrolle signifikant reduzieren. Weitere Wirksamkeitsstudien wurden an Rhesusaffen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden vier Makaken pro Gruppe mit TRES6 oder einem neutralisierenden RBD-bindenden monoklonalen Antikörper GN1 oder Palivizumab als Kontrolle behandelt. Alle Tiere, mit der Ausnahme von zwei mit TRES6 behandelten Tieren, zeigten reduzierte Viruslasten in Sekreten der oberen Atemwege und Bronchoalveolären Lavagen. Durch Sequenzierung der Virusisolate der Tiere mit einer erhöhten Viruslast konnte bestätigt werden, dass bereits zwei Tage nach der Virusexposition die Resistenzmutationen gegen diesen Antikörper aufgetreten waren. Zusammenfassend konnten wir neun Antikörper generieren, welche SARS-CoV-2 in vitro und in vivo neutralisieren. Dies bestätigt, dass Mäuse, die für das menschliche Immunglobulin-Repertoire transgen sind, einen wichtigen Beitrag in Initiativen zur Pandemievorsorge darstellen. Darüber hinaus konnten wir die Notwendigkeit einer gründlichen Untersuchung von Escape-Mutationen unterstreichen, um möglichst wirksame Antikörper Kombinationen für den klinischen Einsatz wählen zu können. Schließlich konnten wir feststellen, dass nicht nur die IC50 eines Antikörpers, sondern auch seine genetische Resistenzbarriere bei der Auswahl von Antikörpern für die Behandlung von SARS-CoV-2 berücksichtigt werden sollte.

DOI
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