Knockout des Chemokinrezeptors M33 des Cytomegalovirus verringert die chronische allogene Abstoßungsreaktion in einem murinen Aortentransplantationsmodell

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2022-11-28
Issue Year
2022
Authors
Fritz, Niklas Martin
Editor
Abstract

Background: Numerous studies suggest that cytomegalovirus (CMV) infection may act as isolated risk factor in the development of cardiac allograft vasculopathy (CAV). Viral G protein-coupled receptors (GPCRs) are thought to contribute to the pathogenic changes associated with CMV infection. The aim of this study was to investigate the role of murine cytomegalovirus GPCR M33 in the development of CAV in a murine aortic allograft model. Methods: MHC I-mismatched aortas of C.B10 (H2b) mice were transplanted into BALB/c (H2d) recipients, which were either mock-infected, infected with wild type (WT) MCMV or MCMV with a deleted M33-receptor gene (delM33). Persistence of cytomegalovirus infection was confirmed by qPCR and by luciferase assay to ensure active viral replication. Grafts were harvested on days 21 and 37 for intragraft mRNA expression and histological analysis. Results: Active viral replication was demonstrated and MCMV presence was confirmed by PCR within spleen, liver, salivary glands, lung and the aortic transplant. Infection with delM33 resulted in significantly less intimal proliferation compared to WT-MCMV but more pronounced proliferation than in mock-infected allografts (32.19% [delM33] vs. 41.71% [WT-MCMV] vs. 24.33% [MCMV-]). Intragraft expression of most analyzed genes was significantly increased in infected mice. VCAM-1, ICAM-1, PDGFβ, CXCR3 and Granzyme B were distinctly less expressed in grafts of delM33 infected compared to WT infected mice. Cellular infiltration revealed reduced dendritic cells and T cells in grafts infected with delM33 compared to WT MCMV. Conclusions: These data suggest that the MCMV encoded receptor M33 plays an important role as a viral effector mechanism contributing to the development of CAV in a murine aortic transplant model.

Abstract

Hintergrund und Ziele: Zahlreiche Studien lassen vermuten, dass eine Infektion mit dem Cytomegalovirus (CMV) einen isolierten Risikofaktur für die Entwicklung der Transplantatvaskulopathie (TV; cardiac allograft vasculopathy, CAV) darstellt. Pathologische Veränderungen der TV sind gekennzeichnet durch eine diffuse, konzentrische und fortschreitende Verdickung der Tunica intima in den Koronaren aber auch der Arteriolen und Kapillaren des transplantierten Herzens. Hierdurch kommt es zu einer progredienten luminalen Okklusion. Trotz Verbesserungen der postoperativen immunsuppressiven Medikation zur Verminderung der allogenen Immunreaktion kommt es im Verlauf zu einer chronischen Abstoßung. Es wird vermutet, dass virale G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zu den pathogenen Veränderungen beitragen, die mit einer CMV-Infektion assoziiert sind. CMV ist spezies-spezifisch, es gibt jedoch funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen den CMV-Stämmen verschiedener Spezies. In Tiermodellen zeigte sich, dass der murine CMV kodierte GPCR M33 (das funktionelle und strukturelle Homolog des von HCMV kodierten GPCR US28) hier von besonderer Bedeutung ist, da ihm eine zentrale Rolle bei der Entwicklung einer latenten MCMV-Infektion zukommt. Das Ziel dieser Studie war nun, die Rolle von M33 bei der Entwicklung der Transplantatvaskulopathie in einem allogenen murinen Aortentransplantationsmodell zu untersuchen. Methoden: BALB/cAnNRj - Mäuse wurden als Empfängertiere ausgewählt, da diese eine verringerte Fähigkeit im Vergleich zu den häufig verwendeten Labormäusen C57BL/6 besitzen, MCMV zu eliminieren. Als Spendertiere für die allogenen Versuchsgruppen wurden C.B10-2(b)/LilMcdJ-Mäuse verwendet, was in einem MHC- I Mismatch mit moderater Abstoßung der transplantierten Aorten resultiert. Diese moderate Abstoßung ermöglicht es besonders gut, die additiven Effekte durch die Infektion mit MCMV auf eine chronische Abstoßung zu quantifizieren. In den syngenen Kontrollgruppen sind sowohl Spender- als auch Empfängertiere BALB/c Mäuse. Die Aortentransplantation erfolgte nach einer modifizierten Technik, dabei wird die thorakale Aorta von Spendermäusen reseziert und als Interponat End-zu-End in die infrarenale abdominelle Aorta der Empfängermäuse mit Einzelknopfnähten implantiert. Die verwendeten Virusstämme wurden in Zusammenarbeit mit Professor Stamminger und seinem Team von dem Institut für Virologie generiert. Hierbei wurden bei dem MCMV-Stamm „Smith“ mehrere Modifikationen vorgenommen. Zum einen erfolgte die Reparatur des mck-2-Gens, welches für die Replikation in den Speicheldrüsen, einem Ort der latenten Viruspersistenz, von entscheidender Wichtigkeit ist. Eine Mutation mit einem Funktionsverlust des mck-2-Gens war durch Jordan und Kollegen 2011 beschrieben worden. Als weitere Modifikation erfolgte die Insertion des Luciferase- Gens aus Glühwürmchen, um später eine aktive Virusreplikation durch in vivo-Imaging nachweisen zu können. Der so „reparierte Wildtyp-(WT)“ Virusstamm diente als Basis für eine weitere Modifikation. Es wurde zusätzlich eine Deletion des für den Rezeptor M33 kodierenden Genabschnittes (delM33-Virusstamm) eingefügt. Um eine gleiche Replikationskinetik der beiden Virusstämme (WT und delM33) sicher zu stellen, wurden in einem Vorversuch, jeweils die Viruslasten in verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Milz, Aorta, Speicheldrüsen) von delM33 oder WT infizierten Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) bestimmt. Um eine aktive virale Replikation nachzuweisen, wurde den Tieren an Tag 3 und 6 nach Infektion D-Luciferin, das Substrat des inserierten Enzyms Luciferase intraperitoneal injiziert und die resultierende Bioluminiszenz mittels eines CCD- Kamerasystems detektiert (in vivo - Imaging). Für das Hauptexperiment wurden syngene und allogene Aortentransplantationen wie oben erläutert durchgeführt. Sieben Tage nach der Transplantation erfolgte eine intraperitoneale Injektion von 1 x 106 pfu WT bzw. delM33 MCMV. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, bei denen statt Virus lediglich Virus Standard Puffer (VSP) intraperitoneal injiziert wurde. Es wurden nur Tiere in den Versuch miteinbezogen, die nach der Infektion eine deutliche Viruslast aufwiesen. Dazu wurde an den Tagen 3 und 6 wie oben dargestellt ein Kontroll - in vivo - Imaging durchgeführt. Zur Analyse der Genexpression wurden am Tag 14 nach der Virusinfektion die abdominellen Aortentransplantate entnommen, da zu diesem Zeitpunkt die höchste Zytokinexpression besteht. In gesonderten Gruppen für histologische/immun- histologische Untersuchungen wurden die Aortentransplantate 30 Tag nach Infektion entnommen und mit Hilfe Kryotom-Querschnitten analysiert. Dabei wurde die luminale Okklusion mit Hilfe von EvG-gefärbten transversalen Schnitten, sowie die Quantifizierung von infiltrierenden Immunzellen wie CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, dendritischen Zellen und Makrophagen ermittelt. Des Weiteren wurde die Verteilung von glatten Muskelzellen (SMC) in Neointima und Media evaluiert. Ergebnisse und Beobachtungen: Die Viruslastbestimmungen mittels qPCR zeigten, dass die verwendeten Virusstämme (WT und delM33) in Leber, Lunge, Milz und thorakaler Aorta die gleiche Replikationskinetik aufwiesen. In beiden Gruppen verringerte sich die Viruslast im Verlauf. Eine Ausnahme stellten die Virustiter in den Speicheldrüsen dar. Hier kam es zu einer Zunahme der Titer bei mit WT infizierten Mäusen, während es zu einer deutlichen und raschen Abnahme der Titer in den mit delM33 infizierten Tieren kam. Dies entsprach unserer Erwartung, da der Chemokinrezeptor M33 eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer latenten Infektion in den Speicheldrüsen spielt. Die Ergebnisse des Hauptversuchs wiesen eine signifikant verringerte chronische Abstoßungsreaktion (gemessen am prozentualen Grad der luminalen Einengung der Aortentransplantate) in den mit delM33 infizierten allogen transplantierten Mäusen auf, verglichen mit den mit WT infizierten Mäusen. Bei keinem der syngen transplantierten Empfängertiere konnte eine relevante Neointimabildung nachgewiesen werden. Die Immunzellinfiltration betrachtend waren signifikant weniger dendritische Zellen (CD11c+) in der Neointima von delM33 infizierten Allotransplantatempfängern verglichen mit WT infizierten Tieren nachzuweisen. Ähnliches zeigte sich bei der Quantifizierung von T-Helferzellen (CD4+). Es gab jedoch keinen Unterschied in den Allografts bezüglich der Infiltration von CD8+ T-Zellen und Makrophagen in die Neointima beider infizierter Gruppen. Bei der Verteilung der glatten Muskelzellen (SMC) zeigte sich, dass bei delM33 infizierten allogen transplantierten Mäusen die SMCs hauptsächlich in der Media zu finden waren, während sie bei den WT infizierten Mäusen etwa gleichmäßig in Media und Neointima verteilt vorkamen. Die Genexpressionsanalyse von Adhäsionsmolekülen und Zytokinen in den Aortentransplantaten zeigte eine Reduktion der mRNA-Expression von VCAM-1, ICAM-1, PDGFβ, CXCR3 und Granzyme B in delM33 infizierten allogenen Transplantatempfängern gegenüber WT infizierten Mäusen. In den syngen transplantierten Aorten fand sich keine Hochregulation der untersuchten Gene.

Schlussfolgerung: Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass der in murinem CMV kodierte Chemokinrezeptor M33 mit seiner Funktion, eine latente Infektion in den Speicheldrüsen aufrechtzuerhalten, die Entwicklung einer chronischen Abstoßungsreaktion begünstigt.

DOI
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