Entwicklung von Nachweismethoden zur Detektion von ZNS-Gewebe in Fleischwaren

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-10-29
Issue Year
2009
Authors
Bäuerlein, Rainer
Editor
Abstract

Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is a fatal brain disease of cattle. After a long incubation period, this transmissible neurodegenerative disease always deadly. BSE differs from other TSE forms found in sheep, cats, hamsters, deers, etc. BSE is most likely to be transmitted to humans, and for this reason, it has become the focus of international attention. The new variant of Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) also affects young people and is uncurable. An EU regulation was passed for consumers protection in order to avoid further cases of vCJD. This regulation includes a classification of different risk materials. Brain and spinal cord (CNS tissue) have the highest infection potential. To control the elimination of this high-risk material in meat and sausages, a reliable and sensitve detection method is required. Myelin proteolipid protein 1 (PLP) allows tissue specific and sensitive detection of CNS material. The aim of this dissertation was to verify a CNS detection method and to develop a new rapid detection method, both depended on PLP. The aim of this rapid detection method was to detect CNS tissue still in the abattoir. Besides, the proteome of bovine brain was analyzed. Conspicuous characteristics should be distinguished for further detection methods. In the first part, PLP was detected by western blotting. It was shown that the meat matrix has no influence on the method. PLP could be detected in minced meat from pork, cattle, lamb, or in a mixture of pork and beef without a decreasing signal. The detection limit for CNS tissue was 0.012 % in unprocessed meat. Hence it can be regarded as a highly sensitive CNS detection method. Furthermore, tissue specificity was tested. Besides CNS tissue, only pure peripheral nervous system tissue showed a very faint signal. However, the signal was lower than that of 1 % bovine brain in meat. Therefore, false positive results by other bovine tissues (except CNS tissue) are not to be expected. The anti-PLP antiserum is not species specific for bovine PLP. It shows a high immunoreactivity to mammalian species and a weak immunoreactvity to avian species. It is possible to differ from CNS contaminations caused by avian and mammalian species. Avian CNS tissue are not defined as risk materials. In a field study, a positive signal could be detected in almost 10 % of the analyzed sausages. Thereby, it could be shown that CNS tissue is not uncommon in retail products. Furthermore, PLP was detected by a dot blot assay. This method, allows a fast analysis with high sample throughput. Here, CNS tissue showed a strong and pure peripheral nerves a weak positive signal. By analyzing the respective tissue, samples of peripheral nerves can be distingushed immediately and, therefore, false positive results are unlikley. The species specificity agrees with the western blot experience. The dot blot assay has a detection limit of 0,01 % CNS tissue in bovine minced meat, but it is only suitable for unprocessed samples. In addition, a rapid detection method based on the dot blot assay was developed. CNS tissue down to 0.5 mg could be detected clearly on beef and surfaces. Storage time up to five days did not interfere with the assay and no false positive signals through tissue contaminants could be measured. By an application of the assay in the abattoir only the area around the medulla oblongata (an extension of the spinal cord = CNS tissue) showed a positive signal. Finally, the proteomes of bovine skeletal muscle and bovine brain was analyzed by twodimensional electrophoresis and then measured by mass spectrometry. The aim was to detect unique proteins in bovine brain. Precipitation with acetone for skeletal muscle and precipitation with a mixture of TBP, acetone and methanol for brain tissue were established as appropiate methods. A total of 66 protein spots were analyzed: 43 protein spots, 22 from skeletal muscle and 21 from bovine brain, could certainly be detected thereof. The non-detectable proteins did not fit in internal established parameters. The glial fibrillary acidic protein (GFAP) can probably be used as a marker for early diagnosis of BSE or for the detection of CNS tissue. In conclusion, the western blot assay and the rapid detection method (both with PLP as marker protein) can be used as a complementary control system for the detection of CNS tissue. By these two methods a broad consumer protection is possible. The development of a reliable proteomic method for bovine brain allows a wide variety of analytical prospects.

Abstract

Die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) ist eine übertragbare Erkrankung von Rindern, die mit schwammartigen Veränderungen im Gehirn einhergeht. Durch die als sicher angesehene Übertragung von BSE auf den Menschen und das damit verbundene Auftreten einer Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit erregte BSE weltweit große Aufmerksamkeit. BSE wird über die Nahrung auf den Menschen übertragen und gilt als unheilbar. Um weitere vCJD-Fälle zu vermeiden, erließ die EU eine Verordnung zum Schutz der Verbraucher. Darin sind verschiedene Risikogewebe klassifiziert. Das größte Infektionsrisiko geht von der Verwendung von Rinderhirn und Rinderrückenmark aus. Um den Ausschluss von ZNS-Gewebe aus Fleisch- und Wurstwaren zu kontrollieren, ist eine verlässliche und sensitive Kontrollmethode erforderlich. Mit dem Myelin Proteolipid Protein 1 (PLP) wurde ein gewebespezifisches Markerprotein gefunden, mit welchem sich noch geringste Mengen an ZNS-Geweben nachweisen lassen. Im Zuge dieser Dissertation galt es, einen ZNS-Gewebe-Nachweis zu optimieren und in der Praxis zu erproben und einen Schnelltest zu entwickeln. Ziel des Schnelltestes war es, ZNS-Kontaminationen die im Schlachthof auftreten, verlässlich nachzuweisen. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit das Proteom des Rinderhirns untersucht. Dabei sollte untersucht werden, ob die Proteomanalytik eine systematische Suche nach Markerproteinen erlaubt. Im ersten Abschnitt der Arbeit wurde PLP mittels Western Blot nachgewiesen. Dabei zeigte sich keinerlei Beeinflussung der Methode durch die verwendete Fleischmatrix. PLP ließ sich sowohl in Schweine-, Rinder-, Lamm- und gemischtem Hackfleisch ohne Signalverlust detektieren. Mit einer Nachweisgrenze von 0,012 % ZNS-Gewebe in unprozessierten Proben stellt die Methode einen hochsensitiven ZNS-Nachweis dar. Außerdem konnte die Gewebespezifität des Testsystems unter Beweis gestellt werden. Ausschließlich reines peripheres Nervengewebe zeigte ein schwaches Signal. Von falsch-positiven Ergebnissen durch zugelassene Rindergewebe ist bei dieser Nachweismethode nicht auszugehen. Das anti-PLP Antiserum ist nicht speziesspezifisch für Rinder-PLP. Es weist allgemein eine starke Affinität zu PLP von Säugetieren und eine schwache zu PLP von Geflügel auf. Damit ist es erstmals möglich zwischen ZNS-Zumischungen von Säugern und Geflügel zu differenzieren. Geflügel-ZNS-Gewebe ist nicht als Risikomaterial definiert. Bei einer durchgeführten Handelsprobenstudie konnte in annähernd 10 % der Proben ein ZNS-positives Signal festgestellt werden. Hierdurch wurde verdeutlicht, dass ZNS-Beimengungen in Wurstwaren keine Seltenheit darstellen. Im Folgenden wurde PLP mittels Dot Blot nachgewiesen. Durch den Dot Blot ist eine schnelle Analyse einer großen Probenanzahl möglich. Hierbei zeigte ebenfalls ZNS-Gewebe ein starkes und reines peripheres Nervengewebe ein schwaches Signal. Es wurde eine Nachweisgrenze von 0,01 % ZNS-Gewebe in Rinderhackfleisch ermittelt. Anschließend wurde, auf der Dot Blot Methode basierend, ein Schnelltest für Oberflächen und Schlachttierkörper entwickelt. Es konnte bis zu 0,5 mg ZNS-Gewebe auf Fleisch und Arbeitsoberflächen nachgewiesen werden. Dieser Test wurde durch eine Lagerzeit der Proben von bis zu fünf Tagen zwischen Kontamination und Probennahme nicht negativ beeinflusst. Ebenfalls konnten keine falsch-positiven Ergebnisse durch Gewebekontaminationen festgestellt werden. Bei Anwendung im Schlachthof wurde nur bei der Probe der Medulla oblongata ein positives Signal festgestellt, während alle anderen Proben ein negatives Signal ergaben. Im abschließenden Abschnitt der Arbeit wurden mittels Zweidimensionaler Gelelektrophorese, mit nachfolgender massenspektrometrischer Bestimmung, die Proteome von Rindermuskulatur und Rinderhirn untersucht. Zunächst konnte mit der Aceton-Präzipitation zur Fällung der Proteine eine geeignete Aufarbeitungsmethode für Rindermuskulatur und mit einer Proteinpräzipitation mit einer Tributylphosphat-Aceton-Methanol-Mischung eine geeignete für Rinderhirn, gefunden werden. Es wurden insgesamt 66 Proteinspots untersucht. Davon konnten 43 Proteinspots, darunter 22 von Rindermuskulatur und 21 von Rinderhirn, sicher identifiziert werden. Die nicht zugeordneten Proteinspots erfüllten nicht die intern festgelegten Auswertungsparameter. Das saure Gliafaserprotein (GFAP) kommt dabei als ein mögliches Markerprotein für ZNS-Nachweise in Betracht. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Western Blot Methode und der Schnelltest - beide mit PLP als Markerprotein - sich ergänzende Kontrollsysteme zum Nachweis von ZNS-Gewebe darstellen. Ein umfassender Schutz der Verbraucher durch die Prozeßkontrolle bei der Fleischgewinnung und die Produktkontrolle ist somit möglich. Durch die Entwicklung einer reproduzierbaren Proteomanalytik von Rinderhirn sind Ansatzpunkte für weitere Nachweismethoden geschaffen worden.

DOI
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