Molekulare Analyse des Makromolekültransportsin Pflanzen anhand eines viralen Transportproteins

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-09-04
Issue Year
2009
Authors
Vogel, Florian
Editor
Abstract

Plasmodesmata (PD) are symplastic connections of adjacent cells and enable the exchange of assimilates as well as the selective transport of macromolecules. Many plant viruses encode for specialized movement proteins (MP), which interact with elements of the symplastic host transport system to facilitate the transport of viral particles or ribonucleprotein complexes to and through PD. This work focused on the 17 kDa MP of the potato leaf roll virus (PLRV MP17) and its interactions with host factors in the model plant Arabidopsis, to investigate the plasmodesmal transport in plants. Pharmacological studies on transgenic Arabidopsis expressing a MP17:GFP fusion protein provided evidence that MP17 is transported to secondary branched PD in source leaves in a -actinand ER-Golgi-dependent process. Conversely, MP17 is not localising to the structural dissimilar simple PD in sink leaves but is instead degraded involving microtubules and the proteasome complex. A genetic approach led to the identification of MP17-sinkmutants, which showed a disrupted degradation of MP17:GFP in sink and eventually accumulation of the fusion protein in single aggregates per cell. These structures were also observed for inhibition of the proteasome-dependent degradation of MP17 in sink or when obstructing transport to PD in source leaves and are structurally similar to aggresomes in mammals. While aggresome-like structures were not described before in plants, they could also be part of a proteasome independent way of protein degradation and serve analogous to human viruses as sites of viral replication. The development of sink into source tissue correlates with the formation of secondary PD accompanied by a more restricted symplastic transport and reduced size exclusion limit of PD. Analysis of senescent leaves in transgenic Arabidopsis showed a reduced PD-localisation of MP17:GFP and its proteasome-mediated degradation products in these leaves, while the MP17:GFP-induced carbohydrate export block was released, indicating functional and structural changes of PD during senescence analogous to sink leaves. To enable the genetic identification of MP17-interacting host factors, MP17-suppressormutants have been generated in the past showing abolition of a MP17:GFP-induced block of the symplastic transport accompanied by stunted growth. The suppressor mutant 10-3-1 was characterised by a wildtype-like phenotype and a specific negative effect on the plasmodesmal association of MP17:GFP offering the opportunity to study symplastic transport without pleiotropic effects. Further characterisation of 10-3-1 and identification of the mutation by map-based cloning revealed a connection of PD structure and a class XI myosin, which was not described before in the context of PD. Phenotypical analysis and map-based cloning of two additional suppressormutants (12-1-1, 17-4-1) confirmed a defect of the endogenous silencing suppressor XRN4 leading to post transcriptional silencing of MP17:GFP in source leaves of both lines. The transgene RNA was not degraded in cotyledons and roots implying an up to now unknown organ specific suppression of transgene silencing. As XRN4 is also involved in miRNA-based silencing, this could point towards an additional antagonistic regulation of miRNA-based control of development in different plant organs. In the last part of this work, a recently described PD mutant carrying a defect in the putative pectate lyase RSX1 was analysed. Initally, the PD localisation of MP17 was checked in rsx1 because of a carbohydrate export block in source leaves, reduced growth and altered PD structure in the phloem of this mutant. Protein and RNA derived from a CaMV 35S-MP17:GFP transgene were present in the mutant background only in mesophyll leaf areas, but not in midribs/petioles, which correlated with RSX1 expression pattern. This tissue specific absence of RNA was also true for other 35S transgenes in rsx1 and could be complemented by RSX1 and the well established viral silencing suppressor P19. While the character of the silencing effect in rsx1 remains to be decrypted, transient over expression of RSX1 abolished silencing of a transgene in N. benthamiana. Thus RSX1 may represent a vascular tissue specific silencing suppressor.

Abstract

Plasmodesmata (PD) stellen zytoplasmatische Verbindungen benachbarter Zellen in Pflanzen dar und gestatten den interzellulären Austausch von Assimilaten sowie den gerichteten Zell-zu-Zell Transport von Makromolekülen wie Proteinen und RNA. Viele pflanzliche Viren kodieren für spezialisierte Movementproteine (MPs), welche mit Elementen des wirtseigenen plasmodesmalen Transports interagieren, um die Beförderung von viralen Partikeln oder onukleoproteinkomplexen zu und durch PD zu ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das MP des potato leaf roll virus (PLRV MP17) und dessen Interaktion mit Wirtsfaktoren in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana studiert, um den plasmodesmalen Transport in Pflanzen zu untersuchen. Pharmakologische Studien an transgenen MP17:GFP-Arabidopsispflanzen zeigten, dass MP17 abhängig von F-Aktin und dem ER-Golgi-Sekretionssystem zu sekundären verzweigten PD in Sourceblättern transportiert wird. In Sinkblättern lokalisiert MP17 nicht an die strukturell unterschiedlichen einfachen PD und wird stattdessen in einem Mikrotubuli- und Proteasomabhängigen Prozess degradiert. In einem genetischen Ansatz konnten MP17-Sinkmutanten identifiziert werden, in welchen der proteolytische Abbau von MP17:GFP gestört war, was unter Anderem zur Akkumulation von MP17 in pro Zelle einzelnen größeren Aggregaten führte. Diese Strukturen waren auch bei der Hemmung des Abbaus von MP17:GFP in Sinkblättern oder dessen Transport zu PD in Sourceblättern beobachtet worden und wiesen Ähnlichkeit zu sogenannten Aggressomen aus Säugern auf. Während Aggresomen-ähnliche Strukturen in Pflanzen zuvor nicht beschrieben wurden, könnten diese auch hier einen Teil der Proteasom-unabhängigen Degradation von Proteinen darstellen. Die Entwicklung von Sink- zu Sourcegeweben korrespondiert mit der Bildung von sekundären PD in Verbindung mit einem selektiverem symplastischem Transport und reduziertem Größenausschlussvolumen der PD. Die Untersuchung seneszierender Blätter transgener Arabidopsis zeigte, dass hier die plasmodesmale Lokalisation von MP17:GFP reduziert, während ein durch MP17:GFP induzierter Block des symplastischen Assimilattransportes aufgehoben war. Dies lässt in Analogie zu Sinkblättern auf eine strukturelle und funktionelle Veränderung von PD während der Seneszenz schließen. Um mit MP17 interagierende Wirtsfaktoren in Sourceblättern genetisch zu identifizieren, waren zuvor MP17-Suppressormutanten erzeugt worden, in welchen ein durch die stabile Expression von MP17:GFP induzierter Block des symplastischen Transports und eine dadurch ausgelöste Wuchsretardierung aufgehoben sind. Eine der Suppressormutanten, 10-3-1, wies einen Wildtypähnlichen Phänotyp und einen spezifischen negativen Effekt auf die plasmodesmale Assoziation von MP17:GFP auf, was ein Studium des symplastischen Transports ohne starke pleiotrope Nebeneffekte ermöglicht. Die weitere Charakterisierung von 10-3-1 und die Lokalisierung der genetischen Veränderung durch Marker-gestützte Kartierung deuten auf eine Verbindung des strukturellen Aufbaus von PD und einem Myosin der Klasse XI hin, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit PD beschrieben wurde. Die phänotypische Analyse und Marker-gestützte Kartierung von zwei weiteren Suppressormutanten zeigte einen Defekt in dem endogenen Silencingsuppressor XRN4, was zu posttranskriptionellem Silencing von MP17:GFP in Sourceblättern beider Linien führte. Allerdings wurde das transgene Transkript nicht in Kotyledonen und Wurzeln degradiert, was eine bislang unbekannte organspezifische Suppression von Transgensilencing nahelegt. Ein weiterer Teilbereich dieser Arbeit behandelt die Untersuchung einer kürzlich beschriebenen PDMutante, welche einen Defekt in der putativen Pektat Lyase RSX1 aufweist. Da die rsx1 Mutante neben einem Kohlehydratexportblock in Sourceblättern sowie reduziertem Wuchs, eine veränderte Struktur von PD im Phloem zeigt, sollte die plasmodesmale Lokalisation von MP17 in rsx1 analysiert werden. Stabil in rsx1 unter CaMV 35S-Kontrolle exprimiertes MP17:GFP assoziierte an PD im Mesophyll aber nicht in Mittelrippen und Petiolen, was jedoch durch die Absenz von MP17:GFP RNA verursacht wurde und mit der leitbündelspezifischen Expression von RSX1 korrelierte. Diese gewebespezifische Absenz von MP17:GFP RNA konnte auch für zwei andere 35S-Transgene in rsx1 festgestellt werden und wurde durch RSX1 sowie den viralen Silencingsuppressor P19 bislang in einem transienten Ansatz komplementiert. Während die Natur des Silencingeffekts in rsx1 noch entschlüsselt werden muss, konnte die Überexpression von RSX1 das Silencing eines anderen Transgens unterbinden. Daraus lässt sich folgern, dass RSX1 einen endogenen Silencingsuppressor spezifisch für Leitgewebe darstellen könnte.

DOI
Document's Licence
Faculties & Collections
Zugehörige ORCIDs