Neutralizing Antibodies to Antigenic Domain 5 of Glycoprotein B of Human Cytomegalovirus

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2014-12-22
Issue Year
2014
Authors
Wiegers, Anna-Katharina
Editor
Abstract

The Human cytomegalovirus (HCMV) is an important, ubiquitously distributed pathogen that causes severe clinical disease in immunocompromised individuals like organ transplant recipients or infants infected in utero. The development of antiviral antibodies is a major defense mechanism against viruses and contributes to the effective control of a HCMV infection. The envelope glycoprotein B (gB) is a major antigen for the induction of virus neutralizing antibodies and hence a component in several experimental HCMV vaccines currently used in humans. However, interpretation of current vaccine results is hampered by significant gaps in our knowledge on neutralizing antibody epitopes on gB. This study focused on the humoral immune response directed against antigenic domain 5 (AD-5) of gB. AD-5 is formed by a continuous sequence comprising residues 133 to 343 of HCMV gB strain AD169. According to a 3D model of HCMV gB, AD-5 corresponds to structural domain I and contains the two internal fusion loops that are required for the fusogenic activity of herpesviral gB. This study identified AD-5 as highly immunogenic and an important target for virus neutralizing antibodies in human sera following HCMV infection, but as being incapable of inducing neutralizing antibodies following immunization of mice. Human monoclonal antibodies (mabs) directed against AD-5 had a broad and potent neutralization capacity. The anti-AD-5 mabs neutralized independent of target cell type or virus origin, complement-independent and as antibody Fab fragments. Furthermore, they prevented cell-to-cell spread of virus in epithelial cells and executed their function at a post-adsorption step. Interestingly, the anti-AD-5 mabs shared a common target site on gB despite originating from different HCMV-infected donors. Mutational analysis of recombinantly expressed AD-5 (n=33) identified an overlapping, discontinuous epitope that consisted of a critical tyrosine residue at position 280 in combination with other surface-adjacent residues, in short, the YNND epitope. The YNND epitope is strictly conserved among different HCMV strains. Recombinant viruses carrying YNND-mutations (n=13) in AD-5 were replication competent but resistant to virus neutralizing mabs. Competition analysis using human HCMV-convalescent sera from unselected donors confirmed the conserved antibody responses to the YNND epitope in HCMV-infected individuals, since a significant fraction of the gB-AD-5 response was found to be directed against this epitope. Moreover, AD-5-specific polyclonal antibodies prepared from individual human sera revealed that the YNND epitope represented the exclusive target for AD-5-directed virus neutralizing activity in some cases. Taken together, the data indicated that AD-5 in general and the YNND epitope in particular represent important target structures for the anti-gB antibody response as well as for the AD-5-specific virus neutralizing activity. The induction of AD-5-specific antibodies following vaccination should be a desirable goal for the development of an effective anti-HCMV vaccine. Furthermore, antibodies targeting the YNND epitope represent powerful tools for passive immunotherapy of HCMV infection.

Abstract

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein ubiquitär vorkommendes Pathogen, das in immunsupprimierten Individuen wie Transplantationspatienten oder kongenital infizierten Neugeborenen zu schwerwiegenden Komplikationen führen kann. Die Entwicklung von antiviralen Antikörpern trägt entscheidend zur effizienten Kontrolle einer HCMV Infektion bei. Das Glykoprotein B (gB) ist ein wichtiges Antigen für die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern und eine wesentliche Komponente von verschiedenen, experimentellen HCMV Vakzinen im Menschen. Die Bewertung bisheriger Vakzinierungs-studien gestaltet sich jedoch schwierig, da wenig über Zielstrukturen für neutralisierende Antikörper auf gB bekannt ist. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der humoralen Immunantwort gegen die antigene Domäne 5 (AD-5) von gB. AD-5 wird aus den Aminosäuren (AS) 133 bis 343 von HCMV gB Stamm AD169 gebildet. Gemäß eines 3D Modells von HCMV gB entspricht AD-5 der strukturellen Domäne I und enthält zwei hydrophobe „Fusion Loops“, welche für die Fusionsaktivität von herpesviralem gB essentiell sind. Zunächst wurde AD-5 als hoch immunogen und als wichtige Zielstruktur von neutrali-sierenden Antikörpern nach HCMV Infektion identifiziert. Drei humane monoklonale Antikörper (mabs), die gegen AD-5 gerichtet sind, neutralisierten unterschiedliche Virus-stämme auf verschiedenen Zelltypen in nanomolaren Konzentrationen. Des Weiteren neutralisierten die anti-AD-5 mabs Komplement-unabhängig und als Fab-Fragmente. Ebenso verhinderten sie die Ausbreitung der Infektion von Zelle zu Zelle in Epithelzellen und inhibierten einen Prozess der Infektion nach der Bindung des Viruspartikels an die Zielzelle. Interessanterweise teilten die anti-AD-5 mabs die gleiche Zielstruktur auf gB, obwohl sie von verschiedenen HCMV-positiven Spendern stammten. Mutationsanalysen mit rekombinant exprimiertem AD-5 (n=33) identifizierten ein überlappendes, diskontinu-ierliches Epitop, welches aus einem Tyrosin an Position 280 und weiteren, strukturell benachbarten AS besteht, kurz das YNND Epitop. Das YNND Epitop ist bei den bekannten Virusstämmen konserviert. Konstruierte rekombinante Viren (n=13), die Mutationen in den kritischen YNND-Resten trugen, waren replikationskompetent, jedoch resistent gegen die Neutralisation durch die anti-AD-5 mabs. Kompetitionsanalysen zufolge war ein Großteil der AD-5-Reaktivität von humanen, HCMV-positiven Seren gegen das YNND Epitop gerichtet, was eine konservierte Immunantwort gegen diese antigene Determinante auf gB bestätigte. Darüber hinaus offenbarten polyklonale AD-5-spezifische Antikörper, die aus Einzelseren aufgereinigt wurden, dass für einige Seren das YNND Epitop die einzige Zielstruktur für neutralisierende Antikörper in AD-5 war. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass AD-5 und insbesondere das YNND Epitop wichtige Zielstrukturen für die humorale Immunantwort und Virus-neutralisierende Antikörper sind. Die Bildung von AD-5-spezifischen Antikörpern nach Vakzinierung sollte ein erstrebenswertes Ziel bei der Entwicklung einer gB-basierten HCMV Vakzine sein. Des Weiteren könnten Antikörper mit YNND-Spezifität vielversprechende Kandidaten für die passive Immuntherapie bei HCMV Infektion darstellen.

DOI
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