Funktionelle und molekulare Charakterisierung von Amer3: ein neuer Regulator des Wnt/beta-catenin-Signalwegs

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-12-03
Issue Year
2013
Authors
Brauburger, Katharina
Editor
Abstract

The APC tumour suppressor protein is an important molecule in the regulation of the Wnt/beta-catenin signalling pathway. APC is necessary for the regulation of proliferation and differentiation in colorectal epithelial cells. Mutations in the APC gene that lead to the expression of C-terminally truncated molecules are the main cause for the development of adenomas in colorectal cancer patients. Recently, two APC interacting proteins, Amer1 and Amer2, that associate with the plasma membrane and regulate the distribution of APC between plasma membrane and the cytoskeleton have been identified.

Amer1 and Amer2 are negative regulators of the Wnt/beta-catenin signalling pathway themselves. Amer1 is necessary for proper embryonal development and its deregulation causes developmental defects and diseases. Inactivating mutations in Amer1 have been reported in Wilms tumours, colorectal carcinomas and the inherited bone disease osteopathia striata. Amer2 is needed for regular brain patterning during Xenopus development.

A third paralogous Amer protein, Amer3, has been identified and defined by sequence similarities to Amer1 and Amer2. Similar to the other Amer proteins, Amer3 interacts with APC by means of conserved amino acid stretches. However, no details are known about molecular characteristics or the functional relevance of Amer3.

In this work, a molecular and functional analysis of Amer3 protein function was carried out. In contrast to the plasma membrane localizing proteins Amer1 and Amer2, Amer3 localizes to the cytoplasm and nucleus of cells. This distribution can be regulated by a functional nuclear import sequence and a nuclear export signal in Amer3. In addition, Amer3 interacts with full length APC and can be recruited to microtubules upon this interaction. Amer3 was also identified as a novel interaction partner of Amer1 which recruits Amer3 to the plasma membrane. Another interaction partner of Amer3 is the negative Wnt regulator Conductin (Axin2). The analysis of Amer3 function revealed that it contains a functional transactivation domain and that it acts as a positive regulator of Wnt/beta-catenin activity in colorectal cancer cells.

Moreover, an Amer-induced posttranslational modification of APC as a functional aspect of the APC-Amer protein interaction was analysed. This analysis revealed that overexpressed Amer1 and Amer2, but not Amer3, can induce the phosphorylation of APC at Serine 780 and that the ability of Amer proteins to induce this phosphorylation correlates with their membrane localization.

Abstract

Das Tumorsuppressorprotein APC (adenomatous polyposis coli) ist ein wichtiger negativer Regulator des Wnt/beta-catenin-Signalwegs und spielt im Darm eine entscheidende Rolle in der Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen. Mutationen, die zu C-terminal verkürzten APC-Molekülen führen, sind die Hauptursache für die Adenom- und Karzinom-Entwicklung in Darmkrebspatienten. Mit Amer1 und Amer2 wurden zwei Plasmamembran-assoziierte APC-Interaktoren identifiziert, welche die Verteilung von APC zwischen Plasmamembran und Mikrotubuli-Zytoskelett regulieren.

Sowohl Amer1 als auch Amer2 sind negative Regulatoren des Wnt/beta-catenin-Signalwegs. Amer1 ist notwendig für eine korrekte Embryogenese und Fehlfunktionen der Proteins führen zu Entwicklungsdefekten und der Entstehung von Krankheiten. Amer1-Mutationen wurden in Wilms- Tumoren, kolorektalen Karzinomen und in der erblichen Knochenkrankheit Osteopathia striata berichtet. Amer2 ist notwendig für die korrekte Musterbildung des Gehirns in Xenopus-Embryonen.

Ein drittes paraloges Amer-Protein, Amer3, wurde anhand seiner Sequenzähnlichkeit zu Amer1 und Amer2 identifiziert. Auch Amer3 interagiert über zwischen Amer-Proteinen konservierte Sequenzbereiche mit APC, jedoch waren die molekularen Details dieser Interaktion und Funktionen dieses neuen Proteins bisher nicht bekannt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das neue Protein der Amer-Familie, Amer3, zum ersten Mal molekular und funktionell analysiert. Anders als Amer1 und Amer2, lokalisiert Amer3 im Zytoplasma und Zellkern und seine Lokalisation wird durch eine Kernimportsequenz und ein Kernexportsignal reguliert. Wie Amer1 und Amer2 auch, interagiert Amer3 mit APC, rekrutiert dieses jedoch nicht an die Plasmamembran, sondern kann von APC an das Mikrotubuli-Zytoskelett rekrutiert werden. Darüber hinaus wurde Amer3 als neuer Interaktionspartner von Amer1 identifiziert, das Amer3 an die Plasmamembran rekrutiert. Ein weiterer Interaktionspartner von Amer3 ist der negative Wnt- Regulator Conductin (Axin2). Auch eine funktionelle Rolle für Amer3 wurde in dieser Arbeit untersucht: Amer3 enthält eine Transaktivierungsdomäne und in kolorektalen Tumorzellen kann Amer3 die Expression beta-catenin-abhängiger Zielgene fördern. Somit ist Amer3, anders als membranassoziierte Proteine der Amer-Familie, ein positiver Regulator beta-catenin-anhängiger Transkription.

Weiterhin wurde eine Amer-induzierte posttranslationale Modifikation von APC als ein funktioneller Aspekt der Interaktion von Amer-Proteinen mit APC untersucht. Die Analyse zeigte, dass überexprimiertes Amer1 und Amer2, nicht aber Amer3, eine Phosphorylierung von APC an Serin 780 induzieren können. Dabei korreliert die Fähigkeit zur Induktion dieser Phosphorylierung mit der Membranassoziation der Amer-Proteine.

DOI
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