The generation of antimicrobial peptides from plants for the preservation of food

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2021-12-20
Issue Year
2021
Authors
Heymich, Marie-Louise
Editor
Abstract

Food contamination by bacteria, viruses, fungi, or parasites have significant implications for the environment and human health. According to the World Health Organization, 350,000 deaths are related to forborne diseases, like salmonellosis, campylobacteriosis, and listeriosis. The most common symptoms of diseases caused by contaminated food are nausea, vomiting, stomach cramps, and diarrhea, which range from mild to life threatening. Although all types of food can be affected, animal products, especially meat and eggs, are the predominant sources of foodborne diseases. Foodborne illnesses can either occur through the ingestion of hazardous microorganisms or through microbial toxins. Bacterial species, such as Pseudomonas spp., and fungal strains, such as Aspergillus spp., are potent food spoilage agents, which make food unacceptable and increase food waste. Hence, physical (cooling, heating, radiation) and chemical (preservatives, essential oils, extracts) preservation techniques are used to avoid microbial contamination. However, common preservation methods have disadvantages, such as resistance mechanisms by bacterial strains or no activity against a broad spectrum of microorganism. Therefore, to enhance food safety and reduce food waste, the development of novel preservatives affecting a wide range of microorganisms is highly important. Furthermore, the increase of consumer standards requires food additives from natural sources with high safety standards for human health. Bioactive peptides are already known for their antioxidative, anticarcinogenic, antihypertensive, and antimicrobial effects. The Antimicrobial Peptide Database (APD) has included 3,257 antimicrobial peptides (AMP) from animals, plants, bacteria, fungi, protists, and archaea sources. Basically, antibacterial activity of peptides can result in two ways. The inhibition of bacterial growth is called bacteriostatic activity, while the bactericidal effect describes the complete inactivation of bacteria. AMPs, especially cationic peptides with amphipathic α-helical structures, interact with the negatively charged bacterial membrane and cause membrane destabilization, followed by membrane disruption. Therefore, virtual screening can be performed to identify potential antibacterial peptides. The first peptide preservative, which was approved for preservation in 60 countries is nisin (E 234), is formed by lactic acid bacteria (Lactococcus lactis) and mainly used for the preservation of cheese. Furthermore, nisin is particularly effective against Gram positive bacterial strains. In addition to antibacterial activity, peptides effective against yeasts, fungi, and molds have also been identified. The APD currently contains 1,204 antifungal peptides and 673 peptides active against yeast. The predominant properties of antifungal peptides and those active against yeast, for example net charge and amphipathic structure, show similarities to the AMPs. These similarities of the structure-activity relationship increase the likelihood that a peptide can be simultaneously antifungal and antibacterial. However, since the membrane composition differs greatly within yeast and fungal strains, the antimycotic action can differ within the fungal strains. Furthermore, antioxidative activity of compounds is used in the food industry to extend the shelf life and improve food quality. Peptides, particularly those containing hydrophobic amino acids such as tryptophan, phenylalanine, proline, isoleucine, and valine, are known to exhibit antioxidative activity. However, since the antioxidative mechanism of peptides has not yet been identified, the prediction of the antioxidative activity based on peptide sequence and structure alone is not possible. The food industry prefers the use of substances with multiple bioactivities to improve food quality and safety. Peptides are mainly produced with peptide synthesis and recombinant synthesis; however, they can also be extracted from natural sources. Enzymatic hydrolysis and fermentation can be used to extract peptides from the food proteins. Nevertheless, especially the purification of the food-derived peptides is labor intensive and cost-effective. In comparison, chemical synthesis, which is the gold standard for peptide production, is expensive and requires several chemicals. Therefore, a promising alternative is the biotechnological production using recombinant synthesis in host cells. The aim of this project was the identification of antimicrobial peptides from plant sources, which can be used as preservatives in food production. Since the antimicrobial peptides are derived from food sources, they are considered as non-toxic and are thus compatible with the clean label strategy. Thus, storage proteins were extracted from wheat, soybean, and chickpea and peptides were generated with enzymatic hydrolysis using the enzyme chymotrypsin. The resulting peptide profiles were comprehensively analyzed by ultra performance micro LC ESI-TripleTOF-MS/MS. The numbers of unique identified peptides were 650 for the soybean glycinin fraction (93 from glycinin), 625 for the soybean β-conglycinin fraction (49 from β conglycinin), 549 for the wheat globulin fraction (43 from globulin), 549 for the wheat gliadin fraction (192 from gliadin), and 1,279 for the chickpea globulin fraction (334 from legumin, 111 from vicilin). Subsequently, antimicrobial peptide candidates were identified by virtual screening using the APD and the structure prediction software I Tasser and Helical Wheel Projection. The main selection criteria were a positive or neutral net charge, a hydrophobic content equal or higher to 20%, the ability to form an amphipathic helical structure, and a good water solubility. Virtual screening was conducted for all storage proteins, however further experiments were limited to chickpea legumin peptides. Therefore, 21 antimicrobial peptide candidates were identified in the peptide profile of the storage protein legumin from chickpea. These peptides were purchased as synthesized peptides produced by solid phase peptide synthesis. Afterwards, the antibacterial activity of the peptides was experimentally tested against the Gram-negative strain Escherichia (E.) coli and the Gram positive strain Bacillus subtilis. Eighteen of the 21 peptides showed antimicrobial activity against E. coli and 17 against Bacillus subtilis. The peptides Leg1 (RIKTVTSFDLPALRFLKL) and Leg2 (RIKTVTSFDLPALRWLKL) had the lowest minimum inhibitory concentration (MIC) of 62.5 µM against E. coli and 15.6 µM against Bacillus subtilis. Moreover, Leg1 and Leg2 were 10 – 1,000 times more active compared to the preservatives sodium benzoate, potassium sorbate, and sodium nitrite. Further studies showed that the two peptides are additionally active against food pathogens, e.g., Clostridium perfringens, antibiotic resistant bacteria, particularly Methicillin resistant Staphylococcus aureus, and yeast strains. To test whether the peptides act bacteriostatic or bactericidal, the microdilution experiments were transferred to agar plates. While the conventional preservatives only inhibit bacterial growth (bacteriostatic activity), the incubation with peptides Leg1 and Leg2, as well as the peptide preservative nisin, showed no bacterial growth on agar and, therefore, have a bactericidal effect. Additionally, the antimicrobial activity of eight randomly selected peptides from chickpea legumin were tested to validate the virtual screening. Four of the peptides exhibited antimicrobial activity at concentrations of 500 µM and 1,000 µM. In comparison, virtual screening, which was performed to identify the peptide candidates in this study, detected AMPs with MIC values less than 100 µM and a hit rate of 76%. In addition, cell toxicity experiments were performed against human colorectal cancer cells. Leg1 and Leg2 showed no cytotoxic effect up to a concentration of 1,000 µM, which is more than 16 times higher compared to the MIC against E. coli. This finding was further confirmed with molecular dynamic simulations. Additionally, to test whether the AMPs Leg1 and Leg2 can be used in combination with commercially used preservatives, the checkerboard assay was performed. The simultaneous application of the antimicrobial peptides Leg1/Leg2 with organic acids, in the present case sodium benzoate, allows a reduced dose of chemical preservatives and may address a wider spectrum of microorganisms. Furthermore, the antioxidative activity was investigated using a radical scavenging and a reducing power assay. Both peptides act antioxidative, however, especially Leg2 showed antioxidative activity, which was comparable to the antioxidant ascorbic acid. The consistent antimicrobial activity of AMPs is important for their use as peptide preservatives. Hence, the MIC was determined with the focus on different extrinsic and intrinsic factors, including storage time, temperature, and pH value. Furthermore, the influence of the counterions trifluoroacetate, acetate, and chloride from peptide synthesis were examined. Leg1 was additionally applied on meat to test the simultaneously effects of pH, water content, salt concentration, and proteases. Leg1 and Leg2 indicated stable antimicrobial activity in solution with slight losses within four weeks and stable activity under food conditions. The antimicrobial activity was consistent within the use of different pH values and counterions. Accordingly, Leg1 and Leg2 can be used in a slightly acidic pH with the non-toxic counterions acetate or chloride. Almost all foods are stored at or below room temperature (20 to 22 °C). Incubation temperatures lower than 37 °C increased Leg1/Leg2 activity and consequently reduced the MIC value. Therefore, a lower peptide concentration is needed at room temperature to ensure microbiological safety. To increase the peptide yield from chickpea legumin, the protocol of the enzymatic hydrolysis was optimized. A shorter digestion time of 4 h and the direct protein hydrolysis without pretreatment, significantly increased the yield by 30 to 110 fold. However, for high scale production in the food industry, the recombinant synthesis may be a good alternative to lower the production costs and time. Thus, Leg1 and Leg2 are novel chickpea-derived antimicrobial peptides with antibacterial, antifungal, antioxidative, and additive antimicrobial activities. They exhibited no cytotoxicity to human cells and, therefore, may be suitable for food preservation, to maintain food safety and to reduce food waste.

Abstract

Kontaminationen von Lebensmitteln mit Bakterien, Viren, Pilzen oder Parasiten führen zu einer großen Menge an Abfall und erhöhen das Risiko lebensmittelbedingter Krankheiten. Demzufolge haben mikrobiologische Verunreinigungen erhebliche Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit. Weltweit sterben pro Jahr rund 350 000 Menschen an den Folgen von lebensmittelbedingten Krankheiten wie Salmonellose, Campylobacteriose und Listeriose. Die häufigsten Symptome von durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten sind Übelkeit, Erbrechen, Magenkrämpfe und Durchfall. Die Krankheitsverläufe können mild bis lebensbedrohlich verlaufen. Obwohl nahezu alle Lebensmittel das Risiko einer Kontamination bergen, weisen vor allem tierische Produkte, insbesondere Fleisch und Eier, eine erhöhte Gefahr auf. Die daraus resultierenden Lebensmittelerkrankungen werden in zwei Gruppen unterteilt. Lebensmittelbedingte Erkrankungen durch den Verzehr von pathogenen Mikroorganismen werden als Lebensmittelinfektionen bezeichnet, während der Begriff Lebensmittelvergiftung die Erkrankung nach einer Aufnahme von mikrobiellen Toxinen beschreibt. Zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit werden in der Lebensmittelindustrie unterschiedliche konservierende Methoden eingesetzt: einerseits physikalische (Kühlung, Erhitzung, Bestrahlung) und andererseits chemische Methoden (Salz, Zucker, Säure, Konservierungsmittel). Die verwendeten Methoden weisen jedoch Nachteile auf, wie zum Beispiel Resistenzen, limitierte Anwendungsmöglichkeiten oder eine fehlende Breitbandwirkung gegen Mikroorganismen. Zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit und zur Verringerung von Lebensmittelabfällen ist die Entwicklung neuartiger Konservierungsmittel mit einer Breitbandwirkung gegen Mikroorganismen von zentraler Bedeutung. Zusätzlich verlangen die steigenden Ansprüche der Verbraucher nach Lebensmittelzusatzstoffen aus natürlichen Quellen mit höchster Sicherheit für die menschliche Gesundheit. Peptide besitzen bioaktive Eigenschaften, wie zum Beispiel antioxidative, antikarzinogene, blutdrucksenkende und antimikrobielle Wirkung. Die Datenbank für antimikrobielle Peptide (APD) umfasst bereits 3257 antimikrobielle Peptide (AMP) aus Tieren, Pflanzen, Bakterien, Pilzen, Protisten und Archaeen. Die antibakterielle Aktivität von Peptiden kann je nach Wirkmechanismus in zwei Klassen unterteilt werden. Die Hemmung des Bakterienwachstums wird als bakteriostatische Aktivität bezeichnet, während der bakterizide Effekt die komplette Inaktivierung der Bakterien beschreibt. Antimikrobielle Peptide, insbesondere, kationische Peptide mit amphipathischer α-Helix-Struktur, wechselwirken mit der negativ geladenen Bakterienmembran. Diese Membrandestabilisierung führt schlussendlich zu einer Zerstörung der Membran. Obwohl der Wirkmechanismus noch nicht vollständig identifiziert wurde, kann eine virtuelle Vorhersage von Peptiden mit potenzieller Aktivität gegen Bakterien aufgrund der Struktur-Wirkungsbeziehung getroffen werden. Wegen der unterschiedlichen Membranbestandteile wechselwirken die AMP mit der Bakterienmembran, aber nicht mit eukaryotischen Zellen und sind somit nicht zytotoxisch für Menschen. Das erste Konservierungsmittel auf Peptidbasis, das bereits in 60 Ländern zur Konservierung zugelassen wurde, ist das von Milchsäurebakterien (Lactococcus lactis) gebildete Nisin (E 234), welche bevorzugt für die Konservierung von Käse verwendet. Neben der antibakteriellen Aktivität wurden Peptide mit Wirkungen gegen Hefen, Pilze und Schimmelpilze identifiziert. Die APD listet derzeit 1877 antimykotische Peptide. Die vorherrschenden Eigenschaften, darunter eine positive Nettoladung und eine amphipathische Struktur, weisen Ähnlichkeiten zu AMP auf. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein Peptid nicht nur antibakteriell, sondern zusätzlich auch antimykotisch wirken kann. Der Membranaufbau unterscheidet sich jedoch innerhalb der Hefen- und Pilzstämme, sodass es im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität nicht möglich ist, einen universellen Wirkmechanismus gegen alle Stämme vorherzusagen. Eine weitere Bioaktivität von Peptiden, die in der Lebensmittelindustrie von Bedeutung ist, um die Haltbarkeit zu verlängern und die Lebensmittelqualität zu verbessern, ist die antioxidative Wirkung. Vor allem Peptide mit hydrophoben Aminosäuren, wie Tryptophan, Phenylalanin, Prolin, Isoleucin und Valin, zeigen eine antioxidative Aktivität. Da der antioxidative Wirkmechanismus jedoch noch nicht ausreichend erforscht ist, kann die Wirkung nicht allein anhand der Peptidsequenz und -struktur vorhergesagt werden. Für die Lebensmittelindustrie bieten Substanzen mit mehreren Bioaktivitäten Vorteile, da sie die Anzahl an Hilfsstoffen für die Verbesserung der Lebensmittelqualität und -sicherheit reduzieren. Die Herstellung von Peptiden kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Die chemische Synthese in Lösung oder mithilfe einer festen Phase wird vor allem bei der Produktion von therapeutischen Peptiden angewandt. Als Alternative können Peptide direkt aus Lebensmittelhydrolysaten mit enzymatischem Verdau oder Fermentation gewonnen werden. Die Isolierung aus dem Lebensmittel ist jedoch ein arbeitsintensiver Prozess, der für jedes Peptid individuell optimiert werden muss. Eine weitere Methode ist die biotechnologische Herstellung mittels rekombinanter Synthese unter Verwendung von Wirtszellen. Diese Methode wird bereits zur Herstellung von therapeutischen Peptiden eingesetzt und ermöglicht, verglichen mit der chemischen Synthese, eine hohe Ausbeute mit geringerem Zeitaufwand und niedrigeren Kosten. Ziel dieses Projekts war es, neue antimikrobielle Peptide aus pflanzlichen Lebensmitteln zu identifizieren, die gegen ein breites Spektrum an Mikroorganismen wirken und als Konservierungsmittel in der Lebensmittelproduktion eingesetzt werden können. Da diese antimikrobiellen Peptide aus einem Lebensmittel stammen, gelten sie als nicht toxisch und sind mit der Clean-Label-Strategie kompatibel. Zu Beginn wurden Speicherproteine aus Weizen, Soja und Kichererbse extrahiert. Die Peptide wurden anschließend unter Verwendung einer enzymatischen Hydrolyse mit dem Enzym Chymotrypsin aus den Speicherproteinen freigesetzt. Die daraus resultierenden Peptidprofile wurden mittels UHPLC-ESI-TripleTOF-MS/MS analysiert. Für die Proteinfraktionen der Sojabohne wurden 650 Peptide in der Glycinin-Fraktion (93 Glycinin-Peptide) und 625 in der β Conglycinin-Fraktion (49 β-Conglycinin-Peptide) identifiziert. Zusätzlich wurde für Weizen 549 Peptide in der Globulin-Fraktion (43 Globulin-Peptide) und 549 Peptide in der Gliadin Fraktion (192 Gliadin-Peptide) sequenziert. Die Ergebnisse der Kichererbse ergaben insgesamt 1,279 Peptide in der Globulin-Fraktion (334 Legumin-Peptide, 111 Vicilin-Peptide). Anschließend wurden die Peptidkandidaten durch virtuelle Vorhersage mithilfe der APD sowie der Strukturvorhersagesoftwares I-Tasser und Helical Wheel Projection identifiziert. Hauptauswahlkriterien waren eine positive oder neutrale Nettoladung, ein hydrophober Anteil von mindestens 20 %, eine amphipathische Helix als Sekundärstruktur und eine gute Wasserlöslichkeit. Obwohl die virtuelle Vorhersage für alle Pflanzenproteine durchgeführt wurde, wurden die folgenden Experimente nur mit dem Kichererbsen-Peptiden aus dem Speicherprotein Legumin durchgeführt. Anhand des Peptidprofils wurden 21 Kandidaten mit potenziell antimikrobieller Aktivität aus dem Legumin identifiziert. Die Peptide wurden als synthetisierte Peptide, welche mit Festphasensynthesis produziert wurden, erworben. Anschließend wurde die antimikrobielle Aktivität der synthetisierten Peptide gegen das Gram negative Bakterium Escherichia (E.) coli und das Gram positive Bakterium Bacillus subtilis getestet. Insgesamt waren 18 Peptide aktiv gegen E. coli und 17 gegen B. subtilis. Die Peptide Leg1 (RIKTVTSFDLPALRFLKL) und Leg2 (RIKTVTSFDLPALRWLKL) zeigten mit 62,5 µM gegen E. coli und 15,6 µM gegen Bacillus subtilis die niedrigste minimale Hemmkonzentration (MIC). In weiteren Versuchen konnte die antimikrobielle Aktivität gegen pathogene Keime, Antibiotika resistente Keime und Verderbserrger, als auch gegen Hefen gezeigt werden. Leg1 und Leg2 waren demnach 10 bis 1000-mal aktiver im Vergleich zu den Konservierungsmitteln Natriumbenzoat, Kaliumsorbat und Natriumnitrit. Um eine bakterizide Aktivität zu bestimmen, wurden zusätzlich wurden Experimente auf Agarplatten durchgeführt. Während die herkömmlichen Konservierungsstoffe das Bakterienwachstum inhibieren (bakteriostatische Aktivität), inaktivieren die Peptide Leg1, Leg2 und Nisin die Mikroorganismen und wirken daher bakterizid. Anschließend wurde die virtuelle Vorhersage validiert, indem der antimikrobielle Assay mit acht zufällig ausgewählten Peptiden aus dem Legumin der Kichererbse wiederholt wurde. Vier der Peptide zeigten eine antimikrobielle Aktivität mit einer Konzentration von kleiner gleich 1000 µM. Im Vergleich dazu identifizierte das virtuelle Screening, das für die Bestimmung der Peptidkandidaten verwendet wurde, AMP mit MIC-Werten von kleiner 100 µM und einer resultierenden Trefferquote von 76 %. Zusätzlich wurde eine Zellstudie an humanen Adenokarzinom-Caco-2-Zellen durchgeführt, um die zelltoxischen Effekte gegen menschliche Zellen zu untersuchen. Leg1 und Leg2 zeigten keinen zytotoxischen Effekt bis zu einer maximalen Konzentration von 1000 µM. Die zytotoxische Konzentration der Peptide ist somit 15-mal höher als die MIC für E. coli. Dieses Ergebnis wurde im Weiteren mit einer molekulardynamischen Simulation bestätigt. Außerdem wurden die synergistischen Effekte mit Hilfe des Checkerboard-Assays untersucht, indem die antimikrobielle Aktivität von Leg1 bzw. Leg2 in Kombination mit Natriumbenzoat gegen E. coli getestet wurde. Beide Peptide zeigten einen additiven Effekt zum verwendeten Konservierungsstoff und können somit in Kombination angewendet werden, um das Wirkungsspektrum zu erweitern. Zusätzlich wurde anhand der radikalfangenden und reduzierenden Eigenschaft die antioxidative Aktivität von Leg1 und Leg2 untersucht. Insbesondere Leg2 zeigte eine antioxidative Aktivität, die Lebensmittel vor der Oxidation schützen kann und dadurch ihre Haltbarkeit und Qualität verbessert. Die Stabilität der antimikrobiellen Peptide ist für deren Einsatz in der Lebensmittelindustrie essenziell und wurde anhand verschiedener Parameter untersucht. Demzufolge wurde die Stabilität bei Lagerung, bei verschiedenen Inkubationstemperaturen, mit unterschiedlichen pH-Werten und unter Verwendung diverser Gegenionen erforscht. Um die Stabilität unter lebensmittelechten Bedingungen zu bestimmen, wurde die antimikrobielle Aktivität von Leg1 auf Fleisch getestet. Das AMP Leg1 zeigte eine stabile antimikrobielle Aktivität in Lösung mit geringen Verlusten innerhalb von vier Wochen. Der pH-Wert von 5,0, die unterschiedlichen Gegenionen Trifluoroacetat, Acetat und Chlorid sowie die Anwendung auf dem Lebensmittel zeigten keinen Einfluss auf die antimikrobielle Aktivität. Demzufolge wirken Leg1 und Leg2 in einem leicht sauren pH-Wert und können als Acetat- oder Chloridsalze verwendet werden. Nahezu alle Lebensmittel werden bei Raumtemperatur (20 – 22 °C) oder kühleren Temperaturen gelagert. Bei niedrigere Inkubationstemperaturen bzw. wirkten Leg1 bzw. Leg2 bereits mit niedrigerer Konzentration und wiesen somit kleinere MIC Werte auf. Daher wird bei Raumtemperatur weniger Peptid benötigt, um die mikrobiologische Sicherheit zu gewährleisten. Um die Peptide aus der Pflanzenquelle zu gewinnen, wurde das Standardprotokoll der enzymatischen Hydrolyse optimiert. Durch den Verzicht auf die chemischen Hilfsstoffe für die enzymatische Hydrolyse und mit einer Inkubationszeit von vier Stunden konnte der Ertrag um das 30- bis 110-Fache erhöht werden. Für die Produktion größerer Mengen in der Lebensmittelindustrie bietet die rekombinante Synthese aufgrund der Kosten und des Aufwandes eine gute Alternative. Bei Leg1 und Leg2 handelt es sich demzufolge um neue, aus der Kichererbse gewonnene, bioaktive Peptide mit antibakterieller, antimykotischer, antioxidativer und additiver Wirkung. Sie zeigten keine Zytotoxizität gegen menschliche Zellen und eignen sich daher möglicherweise für die Lebensmittelkonservierung, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten und Lebensmittelabfälle zu reduzieren.

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