An investigation on antibiotic-free antibacterial materials combining bioresorbable polyesters, chitosan and therapeutic ions

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2019-10-14
Issue Year
2019
Authors
Gritsch, Lukas
Editor
Abstract

Bacterial resistance to antimicrobial agents, especially antibiotics, recently gained worldwide resonance, as more and more authorities start recognizing “superbugs” as a major problem for the future of healthcare. Known drugs are progressively losing efficacy due to excessive use or misuse and the risk of regression to pre-antibiotic death-by-infection rates seems a close reality. This threat demands strong multidisciplinary efforts by the scientific community toward the development of new antimicrobial technologies. Together with optimal functional and biological properties, novel medical devices and tissue engineering scaffolds should also provide an inhibitory effect against bacteria, preferably avoiding the use of conventional antibiotics. In this doctoral thesis, the research has focused on enhancing the antibacterial properties of biodegradable and bioresorbable polyesters (BBPEs), one of the most important classes of polymers for biomedical applications in orthopedics, tissue engineering and drug delivery among others. First, it is demonstrated how this class of materials lacks intrinsic pH-dependent antibacterial activity, a phenomenon that was hinted as a possible consequence of their hydrolytic degradation, albeit not confirmed by previous literature reports. Well-established optical density measurements and agar diffusion assays were performed, confirming that plain bioresorbable polyesters are not active against bacteria. In order to overcome this disadvantage of BBPEs, a novel antibiotic-free antibacterial material based on therapeutic ions-chelating chitosan was prepared and characterized. Chitosan is known to be an ideal ion-carrying polymer thanks to its chelating ability. The complexation of chitosan with several biologically relevant ions (e.g. zinc, cerium, calcium and copper) was investigated and demonstrated by combined analysis with Fourier-transform infrared and energy dispersive X-ray spectroscopies. Among these ions, copper was selected in this project. It acts as a quick inhibitor of bacterial growth and could be used to simultaneously modulate angiogenesis. Copper(II)-chitosan showed excellent antibacterial effect against both Gram-positive Staphylococcus aureus and Gram-negative Escherichia coli, and cytocompatibility with mouse embryonic fibroblasts. In addition to this, copper(II)-chitosan was also characterized in terms of hydrophilicity, ion release and mechanical properties. In particular, the combined analysis of cellular and bacterial behavior, together with ion release, allowed the identification of an optimal threshold copper release concentration of circa 10 to 30 ppm. Within this range, the newly developed material shows outstanding antibacterial inhibition up to 85% of a pure chitosan without significantly affecting the viability of fibroblasts (~70-90% of positive control). Antibacterial copper(II)-chitosan was then used as active agent combined with medical grade polyesters (BBPEs) by means of two relevant fabrication techniques: electrospinning and fabrication of BBPE/copper(II)-chitosan composites. Using a trial-and-error approach, the possibility to produce randomly oriented fiber mats using a blend of copper(II)-chitosan and polycaprolactone was demonstrated. In parallel, the material was also milled to a fine powder and mixed with solutions of several BBPEs, obtaining homogeneous solvent cast BBPE/copper(II)-chitosan composite films with increased swelling and tailorable mechanical properties by varying the matrix composition. In the second part of this study other possible relevant applications of copper(II)-chitosan were explored. For instance, the fabrication of composite freeze-dried scaffolds with interconnected pores made of hydroxyapatite particles dispersed in a chitosan matrix was investigated. The scaffolds were characterized by scanning electron microscopy, nitrogen adsorption analysis and compressive mechanical testing. Bioactivity, in terms of calcium phosphate deposition after immersion in simulated body fluid (SBF), was assessed and the scaffolds were proved able to trigger the deposition of novel mineral phase. Biological characterization was also performed: no significant variation in cell viability and cell morphology was observed compared to a polystyrene positive control. In parallel, the mechanical compliance of copper(II)-chitosan was optimized with plasticizing additives and the resulting material was used to coat polyester (polyglactin 910) surgical sutures by dip-coating. A design of experiment (DOE) approach was used to identify the best combination of solution concentration, type of solvent, pre-coating, dipping and retrieving speed and number of dips to optimize the morphological and mechanical properties of the coated sutures. Coatings produced using a water/acetic acid binary solvent were the most homogeneous and retained circa 100% of the original force at yield of the uncoated suture. The delivery of copper as well as of other therapeutic ions is a promising strategy in the development of novel approaches to produce biomaterials that are simultaneously biocompatible and antibacterial. Metallic ion-chitosan derivatives, and copper(II)-chitosan in particular, are effective and versatile materials. In this thesis several applicative studies were proposed to demonstrate promising directions toward the application of copper(II)-chitosan derivatives in antibiotic-free antibacterial biomaterials for medical devices.

Abstract

Die Widerstandsfähigkeit von Bakterien gegen antimikrobielle Mittel, insbesondere Antibiotika, erhielt in jüngster Vergangenheit weltweite Resonanz, seitdem zunehmend mehr Behörden multiresistente Erreger als ein Hauptproblem für die Zukunft des Gesundheitswesens erkannten. Bekannte Medikamente verlieren durch übermäßigen Gebrauch oder Missbrauch progressiv ihre Wirksamkeit, wodurch das Risiko einer Regression zu vor-antibiotischen Infektionstodesraten als nahe Realität erscheint. Diese drohende Gefahr erfordert umfangreiche multidisziplinäre Anstrengungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft, hin zur Entwicklung neuer antimikrobieller Technologien. Nebst bestmöglicher funktioneller und biologischer Eigenschaften sollen innovative medizinische Geräte und Scaffolds für das Tissue-Engineering eine hemmende Wirkung auf Bakterien haben und möglichst die Verwendung herkömmlicher Antibiotika ausschließen. Ziel dieser Doktorarbeit ist die Verbesserung der antibakteriellen Eigenschaften von biologisch abbaubaren und bioresorbierbaren Polyestern (BBPE), welche eine der wichtigsten Polymerklassen für biomedizinische Anwendungen darstellen und unter anderem in der Orthopädie, im Tissue-Engineering und in der Freisetzung von Medikamenten Anwendung finden. Zunächst haben wir bewiesen, dass diese Materialklasse keine pH-abhängige antibakterielle Aktivität zeigt, ein Verhalten, dass als mögliche Folge ihres hydrolytischen Abbaus gedeutet werden konnte, durch frühere Veröffentlichungen in der Literatur jedoch bisher nicht bestätigt war. Die durchgeführten bewährten Messungen zur Ermittlung der optischen Dichte und Agar-Diffusion-Assays bestätigten, dass bioresorbierbare Polyester keine Wirksamkeit gegen Bakterien haben. Um diesen Nachteil von BBPEs zu überwinden, wurde ein neues antibiotikafreies, antibakterielles Material auf der Basis von therapeutische Ionen chelierendem Chitosan zubereitet und charakterisiert. Chitosan ist aufgrund seines Chelationsvermögens als ideales ionentragendes Polymer bekannt. Wir untersuchten und bewiesen die Komplexierung von Chitosan mit mehreren biologisch relevanten Ionen, unter anderen zum Beispiel Zink, Cerium, Kalzium und Kupfer. Zur Analyse wurde eine Kombination aus Fourier-Transformations-Infrarot- und energiedispersiver Röntgenspektroskopie eingesetzt. Bei den genannten Ionen wurde im Rahmen dieser Studie besonderes Augenmerk auf Kupfer gelegt. Dieses wirkt als schneller Inhibitor des Bakterienwachstums und könnte gleichzeitig zur Modulation der Angiogenese verwendet werden. Chitosan zeigt in Kombination mit Kupfer-Ionen eine ausgezeichnete antibakterielle Wirkung sowohl gegen Gram-positive Bakterien, wie Staphylococcus aureus, als auch gegen Gram-negative, wie Escherichia coli. Ebenso wurde eine Zytokompatibilität mit embryonalen Mausfibroblasten bewiesen. Darüber hinaus wurde Kupfer(II)-Chitosan hinsichtlich seiner Hydrophilie, Ionenfreisetzung und mechanischer Eigenschaften besonders charakterisiert. Die kombinierte Analyse des Verhaltens von Zellen und Bakterien zusammen mit der Ionenfreisetzung ermöglichte die Identifizierung einer optimalen Kupfer-Schwellenwert-Konzentration von etwa 10 bis 30 ppm. In diesem Bereich zeigt unser neuentwickeltes Material, im Vergleich zu einer reinen Chitosan-Kontrolle, eine hervorragende antibakterielle Inhibierung von bis zu 85%, ohne die Viabilität von Fibroblasten signifikant zu beeinflussen (~ 70-90% der Positivkontrolle). Antibakterielles Kupfer(II)-Chitosan wurde daraufhin als Wirkstoff in Kombination mit BBPEs unter Anwendung zweier relevanter Herstellungsverfahren, Elektro-Spinning und Komposit-Herstellung verwendet. Mit einem Versuch-und-Irrtum Ansatz wurde die Möglichkeit demonstriert, zufällig orientierte Fasermatten unter Verwendung einer Mischung aus Kupfer(II)-Chitosan und Polycaprolacton (PCL) herzustellen. Parallel dazu wurde das Material zu einem feinen Pulver gemahlen und mit Lösungen verschiedener BBPEs vermischt. Durch das Variieren der Matrixzusammensetzung konnten aus homogenen Lösungen im Gussverfahren Komposit-Filme mit erhöhter Quellung und anpassbaren mechanischen Eigenschaften generiert werden. Andere mögliche relevante Anwendungen wurden ebenfalls untersucht. Beispielsweise wurde die Herstellung von gefriergetrockneten Scaffolds mit interkonnektierender Porenstruktur aus Hydroxylapatit-Partikeln untersucht, die in einer Chitosan-Matrix eingebettet waren. Die Gerüste wurden durch Rasterelektronenmikroskopie, Stickstoffadsorptions-Analyse und Druckversuchen charakterisiert. Die Bioaktivität wurde in Bezug auf die Kalziumphosphatablagerung nach Eintauchen in simulierter Körperflüssigkeit bewertet. Die Scaffolds lösten dabei die Ablagerung einer neuen Mineral-Phase aus. Eine biologische Charakterisierung wurde ebenfalls durchgeführt. Signifikante Unterschiede in der Viabilität der Zellen und ihrer Morphologie konnten nicht beobachtet werden. Parallel dazu wurde die mechanische Dehnbarkeit von Kupfer(II)-Chitosan durch den Zusatz von Weichmachern optimiert und das resultierende Material wurde verwendet, um Fäden aus Polyester (Polyglactin 910) durch Eintauchen zu beschichten. Ein Versuchsplanungs- (Design of Experiments, DOE) Ansatz wurde verwendet, um die beste Kombination aus Lösungskonzentration, Lösungsmittel, Ein- und Auftauchgeschwindigkeit sowie der Anzahl der Eintauchvorgänge zu ermitteln, um die morphologischen und mechanischen Eigenschaften der Fäden zu optimieren. Die Abgabe von Kupfer sowie anderer therapeutischer Ionen ist eine vielversprechende Strategie bei der Entwicklung neuer Ansätze zur Herstellung von Biomaterialien, die gleichzeitig biokompatibel und antibakteriell sind. Ion-Chitosan-Derivate und insbesondere Kupfer(II)-Chitosan sind wirksame und vielseitige Werkstoffe. In dieser Arbeit haben wir mehrere Anwendungsstudien vorgeschlagen, mit welchen wir glauben, vielversprechende Richtungen für die Anwendung von Ionen-Chitosan Derivaten in antibiotikafreien antibakteriellen Biomaterialien für medizinische Geräte zu bieten.

DOI
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