Differenzierung physiologischer Gewebearten mit der Raman-Spektroskopie: Grundlagenuntersuchung für die Entwicklung einer optischen Biopsie oraler Malignome

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2019-07-22
Issue Year
2019
Authors
Motz, Johanna
Editor
Abstract

Background and objective:

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) of the oral cavity is a serious disease. It is often diagnosed at an advanced stage (T3, T4) and associated with a low relative survival rate of 5-years (48% for men, 61% for women) and a strong impairment of life quality. Experts agree that reliable early diagnosis is a crucial step in improving the outcome parameters in patients with OSCC. Conventional screening measures for the early diagnosis of OSCC depend strongly on the subjective experience and visual limitations of the practitioner. One solution to make early detection safer and more reliable is provided by Raman spectroscopy (RS). RS is already established in the technical field as a highly sensitive and precise material analysis method. The transfer of this optical method to the biological-medical field as a sort of a non-invasive optical biopsy should allow an objective and reproducible assessment of the investigated oral tissue at the molecular level. The aim of this project was the development of an instrumental set-up for the collection of Raman spectra of biological tissue, the correction of the very weak Raman signal from often strong fluorescence overlays, as well as the evaluation of the selected exposure and acquisition parameters for a time-effective and at the same time non-invasive application to various biological tissues. In form of a fundamental research, the Raman spectra of various physiological tissue types of the facial region of the pig were then collected and examined for their differentiability in order to evaluate the potential of Raman spectroscopy as a diagnostic tool for human oral mucosal changes.

Methods: The spectra of the investigation were carried out with a laser power of 100 mW, an integration time of 100 ms and an excitation wavelength of 785 nm. The Raman spectra of six different types of tissue from the facial region of the pig (fat, nerve, skin, mucosa, cortex and cancellous bone) were first largely mathematically adjusted by the iterative polynomial-fitting method from the superimposed fluorescence signal. Subsequently, the Raman spectra were classified using Principal Component Analysis and 2

Linear Discriminant Analysis. Subject of classification were the spectra of 2 different tissues. For the classification the six tissue types were combined in 7 different constellations. The optimal number of principal components as well as the optimal classifier for the differentiation of the tissue samples were determined by cross-validation.

Results: The differentiation of the tissue combinations fat vs. mucosa and nerve vs. skin with the selected excitation and acquisition parameters was free of error (sensitivity: 100 %, specificitiy: 100 %). Fat vs. cortical bone succeeded in differentiation with a sensitivity of 100 % and a specificity of 99.38 %. For skin vs. cancellous bone the assignment of the Raman spectra to the corresponding tissue types was possible with a sensitivity of 93.87 % and a specificity of 95.54 %. For the combination fat vs. nerve the differentiation was done with a sensitivity of 91,41 % and a specificity of 92,99 %. The differentiation of skin vs. mucosa achieved a sensitivity of 78.98 % and a specificity of 77.91 %. For cancellous bone vs. cortical bone it was a sensitivity of 72,50 % and a specificity of 72,50 %.

Conclusion: The results show that a suitable set-up has been developed, with which Raman spectra can be obtained without damaging the examined tissue. The Raman signal could for the most part be mathematically separated from the superimposed fluorescence signal by iterative polynomial fitting. Thanks to the very short integration time (Raman signal detection time) of 100 ms and the use of a portable probe (Ventana-785-ProbeVP785-0009, Oceanoptics), a future in vivo application to oral mucosa seems possible. A differentiation of the compared samples is possible if the tissue types differ significantly in their molecular structure while the reliability of the method decreases the more similar the samples are in this structure. The next key step for a more reliable differentiation is seen in an improved signal processing chain to eliminate the fluorescence signal, so that even subtler differences in the spectra can be detected by PCA and LDA.
Thus, the aim of this paper to contribute to research of the fundamentals of the application of RS for differentiation of biological tissue types, has been achieved. Still, for the developement of an optical diagnostic instrument for the early detection of oral malignancies, further intensive research remains to be done.

Abstract

Hintergrund und Ziele: Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle stellen eine ernst zu nehmende Erkrankung dar, die zumeist erst in einem fortgeschrittenen Stadium (T3, T4) erkannt wird und mit einer geringen relativen 5-Jahres-Überlebensrate (Männer 48%, Frauen 61%) sowie einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität einher geht. Experten sind sich einig, dass eine zuverlässige Frühdiagnose ein entscheidender Schritt bei der Verbesserung der Outcome-Parameter bei Patienten mit OSCC darstellt.
Konventionelle Screeningmaßnahmen zur frühen Diagnosestellung des OSCC sind der subjektiven Erfahrung und den visuellen Limitationen des Behandlers unterworfen. Einen Lösungsansatz um die Früherkennung sicherer und zuverlässiger zu gestalten, bietet die Raman-Spektroskopie, welche im technischen Bereich bereits als hochsensitives und präzises Materialanalyseverfahren etabliert ist. Der Transfer dieser optischen Methode auf den biologisch-medizinischen Bereich soll, im Sinne einer nichtinvasiven optischen Biopsie, eine objektive sowie reproduzierbare Klassifizierung des untersuchten oralen Gewebes auf molekularer Ebene ermöglichen. Ziel des vorliegenden Projekts war die Erarbeitung eines instrumentellen Setups zur Erhebung von Raman-Spektren biologischen Gewebes, die Bereinigung des sehr schwachen RamanSignals von oft starken Fluoreszenzüberlagerungen sowie die Evaluation der gewählten Belichtungs- und Aufnahme- Parameter für eine zeiteffektive und gleichzeitig nicht-invasive Anwendung an verschiedenen biologischen Geweben. Im Sinne einer Grundlagenuntersuchung wurden anschließend die Raman-Spektren verschiedener physiologischer Gewebearten des Kopf- Halsbereiches des Schweines erhoben und auf ihre Differenzierbarkeit hin untersucht, um das Potenzial der Raman-Spektroskopie als Diagnoseinstrument bei Mundschleimhautveränderungen des Menschen zu evaluieren.

Methoden: Es wurden die Raman-Spektren von sechs verschiedenen Gewebearten aus der Gesichtsregion vom Schwein (Fett, Nerv, Haut, Mukosa, Kortikalis und Spongiosa) erhoben. Es wurde mit einer Laserleistung von 100 mW, einer Integrationszeit von 100 ms und einer Anregungswellenlänge von 785 nm gearbeitet. Die Spektren wurden mathematisch mittels eines Iterativen Polynomial Fitting Algorithmus weitgehend vom überlagerten und beeinträchtigenden Fluoreszenz-Signal bereinigt. Anschließend wurden die Spektren unter Nutzung der Hauptkomponenten-Analyse und der Linearen Diskriminanzanalyse in sieben verschiedenen Paar-Kombinationen differenziert. Die optimale Anzahl an Hauptkomponenten sowie der optimale Klassifikator zur Differenzierung der Gewebeproben wurden mittels Kreuzvalidierung ermittelt.

Ergebnisse: Es gelang die Differenzierung der Gewebe-Kombinationen Fett vs. Mukosa sowie Nerv vs. Haut mit den gewählten Anregungs und Aquisitionsparametern fehlerfrei (Sens.: 100 %, Spez.: 100 %). Bei Fett vs. Kortikalis gelang die Differenzierung mit einer Sensitivität von 100 % und einer Spezifität von 99,38 %. Bei Haut vs. Spongiosa war die Zuordnung der Raman-Spektren zu den entsprechenden Gewebearten mit einer Sensitivität von 93,87 % und eine Spezifität von 95,54 % möglich, bei Fett vs. Nerv mit einer Sensititvität von 91,41 % und einer Spezifität von 92,99 %. Die Differenzierung von Haut vs. Mukosa gelang mit einer Sensitivität von 78,98 % und einer Spezifität von 77,91 %. Bei Spongiosa vs. Kortikalis betrug die Sensitivität 72,50 % und die Spezifität 72,50 %.

Schlussfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, dass ein geeignetes Setup entwickelt wurde, mit dem RamanSpektren erhoben werden können, ohne dass das untersuchte Gewebe Schaden nimmt. Das Raman-Signal konnte mathematisch mittels Iterativen Polynomial Fitting Algorithmus weitgehend vom überlagernden Fluoreszenz-Signal getrennt werden. Dank der mit 100 ms sehr kurzen Integrationszeit (Zeitspanne der RamanSignaldetektion), sowie der Verwendung der tragbaren Messsonde (Ventana-785Probe-VP785-0009, Oceanoptics) ist eine zukünftige in vivo Anwendung an oraler Schleimhaut umsetzbar. Eine Differenzierung der verglichenen Proben ist möglich, 5

wenn sich die Gewebearten in ihrem molekularen Aufbau stark unterscheiden und nimmt in ihrer Zuverlässigkeit ab je ähnlicher sich die Proben in diesem Aufbau sind. Der entscheidende nächste Schritt für eine zuverlässigere Differenzierung wird in einer verbesserten Signal-Verarbeitungskette zur Eliminierung des FluoreszenzSignals gesehen, so dass auch subtilere Unterschiede in den Spektren mittels PCA und LDA erkannt werden können. Dem Titel dieser Arbeit, die Grundlagen der Anwendung von RS zur Differenzierung biologischer Gewebearten weiter zu erforschen, um so einen Beitrag zur Entwicklung eines optischen Diagnoseinstruments zur Früherkennung oraler Malignome zu leisten, konnte somit Rechnung getragen werden. Für die tatsächliche Entwicklung eines solchen Diagnoseinstruments ist noch weiterer intensive Forschung nötig.

DOI
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