Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation des AtSUC2-Promotors beim Sink/Source-Übergang im Blatt und Analyse der Gene AtINT2 und AtINT4

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2005-09-19
Issue Year
2005
Authors
Schneidereit, Alexander
Editor
Abstract

In higher plants young, developing leaves represent “sink tissues”, as they depend on photoassimilate import from fully developed “source leaves”. The transition from sink to source, i.e. the reorientation of a carbohydrate importing to an exporting tissue, marks an incising physiological and metabolic change in the leaf, starting in the leaf tip and proceeding to its base. In the model plant Arabidopsis thaliana and many other higher plants sucrose thereby represents the major transport form of carbohydrates and is transferred to “sink tissues” in the phloem. Regarding the transcriptional regulation of the sink/source-transition, there is only a very limited knowledge. The AtSUC2-promoter is not only driving the cell-specific expression of the AtSUC2 sucrose-H+-symporter, the onset of expression in the leaves is also correlating with the “source”-status. Therefore AtSUC2 can be regarded as a model gene for the sink/source-transition and is suitable to study its transcriptional regulation. Thus the main objective of this work was the identification of cis-elements responsible for this specific expression. Furthermore efforts were made to isolate interacting transcription factors. Using promoter-deletions, minimal-promoter analyses, linker-scannings and mutational analyses, two cis-elements of 8 bp and 14 bp, respectively, could be localized exactly. These sequences exhibit high homology to the known binding-sites of two classes of plant transcription factors. Moreover, in the context of the native promoter a third element is involved in the expression. The three cis-elements act in a synergetic manner to obtain expression with full strength, two of them in arbitrary combination are necessary and sufficient for an almost normal expression. Whereas the direct screening of cDNA expression-libraries and a “yeast-one-hybrid”-assay remained unsuccessful for the first two elements, a known transcription factor could be identified as a putative interaction partner for the third cis-element. An additional aspect of the transcriptional regulation of AtSUC2 is the putative induction of the gene in syncytia, which are established in Arabidopsis roots upon infection with the cyst nematode Heterodera schachtii and act as “nematode feeding sites”. Using the techniques mentioned above it could be clearly shown that a postulated nematode-specific cis-element is not responsible for the enhanced transcriptional activity of AtSUC2 in infected roots. Meanwhile we were able to prove that in fact the promoter is not active in syncytia, but in the companion cells of the de novo established phloem surrounding them. A last topic of this work was the tissue-specific localization and functional characterization of the two putative myo-inositol transport proteins AtINT2 and AtINT4. Therefore the cDNAs of both genes were cloned and expressed in the heterologous system Saccharomyces cerevisiae. The expression pattern of both transport proteins was analyzed using tissue-specific RT-PCR and transgenic promoter-reportergene plants.

Abstract

Bei Höheren Pflanzen gehören die jungen, sich entwickelnden Blätter zu den sog. „Sink-Geweben“, da sie auf den Import von Photoassimilaten aus den voll entwickelten „Source-Blättern“ angewiesen sind. Der Übergang von Sink nach Source, d.h. die Umorientierung eines Kohlenhydrat importierenden zu einem exportierenden Organ, stellt eine einschneidende physiologische und metabolische Veränderung im Blatt dar. Sie beginnt in der Blattspitze und schreitet zur Blattbasis hin fort. Dabei dient in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana -wie in vielen Höheren Pflanzen- Saccharose als Haupttransportform für Kohlenhydrate und das Phloem stellt den Transportweg in die „Sink-Gewebe“ dar. Bezüglich der transkriptionellen Regulation des „Sink/Source“-Übergangs gibt es bisher kaum Erkenntnisse. Der AtSUC2-Promotor steuert nicht nur die zellspezifische Expression des AtSUC2 Saccharose-H+-Symporters in den Geleitzellen des Phloems, das Einsetzen der Expression in den Blättern korreliert zudem mit der Ausbildung des „Source“-Zustands. AtSUC2 kann daher als Modellgen für den „Sink/Source“-Übergang angesehen werden und die Analyse dieses Promotors erlaubt somit die Untersuchung der transkriptionellen Regulation während dieses Übergangs. Das Hauptziel dieser Arbeit lag daher in der Lokalisierung der für diese spezifische Expression verantwortlichen cis-Elemente. Darüber hinaus wurde der Versuch unternommen, die mit diesen cis-Elementen interagierenden Transkriptionsfaktoren zu identifizieren. Durch Promotordeletionen, Minimalpromotor- und Linkerscanning-Analysen sowie Mutation im nativen Promotor konnten zwei cis-Elemente von 8 bp bzw. 14 bp Länge exakt lokalisiert werden. Diese Sequenzen weisen hohe Homologie zu den bekannten Bindemotiven zweier Klassen pflanzlicher Transkriptionsfaktoren auf. Zudem konnte gezeigt werden, dass im Kontext des nativen Promotors ein drittes Element an der Expression beteiligt ist. Alle drei tragen synergetisch zur vollen Expressionsstärke bei, je zwei sind für eine annähernd normale Expression notwendig und hinreichend. Während das direkte Screening von cDNA-Expressionsbanken und ein „One-hybrid“-Ansatz zur Identifizierung von Interaktionspartnern für die beiden ersten Elemente erfolglos blieb, konnte damit ein bekannter Transkriptionsfaktor als potentieller Interaktionspartner für das dritte Element identifiziert werden. Einen weiteren Aspekt der transkriptionellen Regulation von AtSUC2 stellt die potentielle Induktion des Gens in Syncytien dar, einem Nährzellengewebe, das nach Infektion mit dem Nematoden Heterodera schachtii in den Wurzeln von Arabidopsis gebildet wird. Diesbezüglich konnte durch die oben beschriebenen Techniken eindeutig bewiesen werden, dass ein postuliertes nematodenspezifisches cis-Element nicht an der verstärkten transkriptionellen Aktivität von AtSUC2 in infizierten Wurzeln beteiligt ist. Vielmehr konnte inzwischen bewiesen werden, dass der Promotor nicht in Syncytien aktiv ist, sondern in den Geleitzellen des de novo darum gebildeten Phloems. Einen letzten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit stellte die gewebsspezifische Lokalisierung und die funktionelle Charakterisierung der beiden putativen myo-Inosit-Transporter AtINT2 und AtINT4 dar. Zur Charakterisierung wurden die cDNAs der beiden Gene kloniert und in Saccharomyces cerevisiae heterolog exprimiert. Durch gewebsspezifische RT-PCR und die Analyse transgener Promotor-GUS- bzw. Promotor-GFP-Pflanzen konnten zudem die Expressionsorte der beiden Transporter in planta ermittelt werden.

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