GMP-Produktion von aufgereinigten humanen B-Lymphozyten für den adoptiven Transfer in Patienten nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2019-10-07
Issue Year
2019
Authors
Tittlbach, Hannes
Editor
Abstract

Abstract BACKGROUND: We have recently shown that memory B cells from murine CMV immune donor animals adoptively transferred into immunodeficient mice were highly effective in protecting from a viral infection indicating a therapeutic potential of virus specific memory B cells. These preclinical data provided evidence that a cell-based strategy supporting the humoral immune response might be effective in a clinical setting of immunodeficiency after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. As adoptive transfer of B cells has not been used before in a clinical setting it was necessary to establish a technology for the generation of good manufacturing practice (GMP)-grade B cell products.

METHODS: Starting from the leukapheresis product of healthy blood donors, B cells were purified by two different separation strategies using GMP-grade microbeads and the CliniMACS system. A one-step protocol was used for positive enrichment of B lymphocytes with anti-CD19 microbeads. In a two-step enrichment protocol, first T lymphocytes were depleted by anti-CD3 microbeads and the remaining fraction was positively selected by anti-CD19 microbeads.

RESULTS: The purity and recovery after enrichment of B lymphocytes from the leukapheresis material in both separations strategies was not statistically different. However, contamination of the B-cell product with T cells was significantly lower after the two-step protocol (0.16%, range 0.01-0.43% after two-step separation and 0.55%, range 0.28-0.85% after one-step separation, p < 0.05). Therefore, a combined CD3 depletion and CD19 enrichment was used for the production of GMP-conform B-cell products from the leukapheresis material of 17 healthy stem cell donors. The absolute B-cell numbers obtained in the final product was 4.70 ± 3.64 × 108 with a purity of 95.98 ± 3.31% B lymphocytes and a recovery of 18.9 ± 10.6%. Importantly, the contamination with CD3+ T cells was extremely low in the final B- cell products (0.10 ± 0.20%). Purified B cells exhibited normal antibody production after in vitro stimulation and showed excellent viability after cryopreservation.

CONCLUSIONS: A GMP-grade B-cell product can be obtained with high purity and very low T-cell contamination using the two-step enrichment protocol based on CliniMACS® technology.

Abstract
  1. Zusammenfassung

1.1 Hintergrund Patienten nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation zeigen eine langanhaltende Immunsuppression, welche unter anderem auch die T- und BLymphozyten betrifft. Die humorale Reaktion auf die Impfung als Maß für die funktionelle B-Zell-Immunität ist in den ersten Monaten nach Stammzelltransplantation unzureichend und erholt sich normalerweise innerhalb von ein bis zwei Jahren. Während dieser Immunsuppression sind die Patienten sehr anfällig für bakterielle, virale und Pilzinfektionen. Unter den viralen Erkrankungen, welche die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität sind, stellt die Prophylaxe und Therapie des humanen Cytomegalovirus (HCMV) eine der größten Herausforderungen dar. Es konnte gezeigt werden, dass Gedächtnis-B-Zellen von CMV-infizierten Mäusen, die adaptiv in immundefiziente Mäuse transferiert wurden, hochwirksamen Schutz vor einer Virusinfektion bieten. Dies lässt auf ein therapeutisches Potential von virusspezifischen Gedächtnis-B-Zellen schließen, welche während der Immunschwäche nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation wirksam sein könnten. Da der adaptive Transfer von B-Zellen noch nie zuvor in einer klinischen Studie untersucht wurde, war es zunächst notwendig, eine geeignete Technologie für die Herstellung von B-ZellenProdukten mit guter Herstellungspraxis (Good Manufacturing Practice, GMP) zu etablieren.

1.2 Methoden Bei der in dieser Arbeit dargestellten Methode wird von einem Leukapherese-Produkt gesunder Blutspender ausgegangen. Es wurden B-Zellen durch zwei unterschiedliche Trennstrategien unter Verwendung des CliniMACS-Systems® der Firma Miltenyi Biotec unter GMP-Bedingungen aufgereinigt. Dieses System verwendet mit magnetischen 2

Partikeln gekoppelte Antikörper (sog. Microbeads) welche zunächst an die zu markierenden Zellen binden. Daraufhin werden die Zellen mit Hilfe einer magnetischen Apparatur von den übrigen Zellen im Präparat getrennt. Ein Ein-Schritt-Protokoll wurde zur positiven Anreicherung von B-Lymphozyten mit Anti-CD19-Microbeads verwendet. In einem zweistufigen Anreicherungsprotokoll wurden zuerst die T-Lymphozyten durch AntiCD3-Microbeads abgereichert und die verbleibende Fraktion wurde positiv durch AntiCD19-Microbeads selektiert. Während aller Schritte des Herstellungsprozesses wurden Proben mithilfe von Durchfluss-zytometrischen Messungen (FACS) auf den Zellgehalt der unterschiedlichen Zellpopulationen überprüft.

1.3 Ergebnisse Die Reinheit des Endproduktes war hinsichtlich der B-Lymphozyten aus dem Leukapherese-Material in beiden Trennungsstrategien statistisch nicht unterschiedlich. Die Kontamination des B-Zell-Produkts mit T-Zellen war jedoch nach dem Zwei-StufenProtokoll signifikant niedriger (0,16% nach zweistufiger Trennung und 0,55% nach einstufiger Trennung; p < 0,05). Daher wurde eine kombinierte CD3-Depletion und CD19Anreicherung zur Herstellung von GMP-konformen B-Zell-Produkten aus dem Leukapherese-Material von 17 gesunden Stammzellspendern eingesetzt. Die absoluten BZell-Zahlen, die im Endprodukt erhalten wurden, betrugen 4,70 ± 3,64 × 108 mit einer Reinheit von 95,98 ± 3,31% und einer Gesamtausbeute von 18,9 ± 10,6% der im Ausgangsprodukt enthaltenen B-Lymphozyten. Es konnte eine extrem niedrige Kontamination mit CD3 + T-Zellen in den fertigen B-Zell-Produkten erreicht werden (0,10 ± 0,20%). Die aufgereinigten B-Zellen zeigten nach in vitro-Stimulation eine normale Antikörperproduktion und nach Kryokonservierung eine hervorragende Vitalität (> 90%).

1.4 Schlussfolgerungen Es zeigte sich allerdings bei der detaillierten Überwachung des Prozesses eine signifikante Anzahl von B-Zellen innerhalb der Nicht-Zielfraktion nach CD3-Depletion. Zwei mögliche Ursachen für diesen unerwarteten Verlust von B-Zellen wurden diskutiert: Erstens könnte die Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung von B-Zellen an die Anti-CD3-Antikörperbeschichteten Microbeads zum Verlust von B-Zellen führen. Es wurde versucht diese Bindung zu reduzieren, indem humane IgG-Präparate, wie sie im klinischen Gebrauch eingesetzt werden zum Präparat hinzugefügt wurden, um die Fc-Rezeptoren der BLymphozyten abzusättigen. Alternativ könnten zukünftige Studien das kürzlich eingeführte CliniMACS TCRαβ-Biotinreagenz verwenden, das möglicherweise weniger an B-Zellen bindet. Als eine zweite Möglichkeit könnten T-Zell-B-Zell-Dubletts oder sogar Multimere nach einer unzureichenden Resuspendierung der Zellen in den Präparationstaschen für den Verlust von B-Zellen in der Nicht-Zielfraktion verantwortlich sein. Eine automatisierte Zellverarbeitung einschließlich Zentrifugationen im CliniMACS Prodigy-System könnte die Bildung von Dubletts reduzieren. Zusammenfassend konnte ein B-Zellen-Produkt mit GMP-Qualität, hoher Reinheit und sehr geringer T-Zell-Kontamination unter Verwendung des zweistufigen Anreicherungsprotokolls auf der Grundlage der CliniMACS®-Technologie erhalten werden.

DOI
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