RNA-Interferenz und das Suizidgen tBid als neue Ansätze gentherapeutischer Strategien gegen HIV-1

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Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2008-09-17
Issue Year
2007
Authors
Hülsmann, Peter
Editor
Abstract

HIV-1 infection is currently not curable despite improving therapy options. Furthermore, the appearance of drug-resistant viruses complicates the treatment of HIV-1 infected persons and leads in a substantial number of patients to therapy failure. New therapeutic strategies against HIV-1 are urgently needed. Therefore, different antiretroviral strategies in the fight against HIV-1 were tested regarding their potential therapeutic use. RNA interference as a new antiretroviral strategy against drug-resistant HIV-1 variants: The possibility to specifically target drug-resistant viruses was investigated.. It could be demonstrated that siRNAs targeting either wild-type HIV-1 or the lamivudine-resistant variant HIV-1M184V inhibits replication of the corresponding virus, but does not influence replication of virus with a mismatch in the targeted region. Combining two effective siRNAs did not show synergistic inhibitory effect on HIV-1 replication. However, a combination of lamivudine and siRNA–M184V was very effective in inhibiting replication of both wild-type and variant M184V viruses in mixed infection experiments. Taken together, these results demonstrate that RNA interference might be useful in the treatment of drug-resistant HIV-1 infection. Protein substitution system as a new antiretroviral strategy against HIV-1. A novel strategy targeting a cellular protein that is essential for virus replication and less easily modifiable was investigated. The human cell surface protein CD4 is required for the entry of HIV into cells and was therefore chosen as proof-of-principle: An inducible expression system to knock down CD4 using RNAi and to replace it simultaneously with a mutated variant was generated. Suppression of CD4 by microRNA and induction of the mutated CD4 variant – not permissive for HIV-1, not inhibited by RNAi, and maintaining its physiological functions – was regulated by a novel tetracycline-dependent regulation system. Thus, four expression plateaus were reproducibly achieved using different tetracycline derivatives. Inhibition of HIV-1 replication can be achieved by this novel gene therapeutic strategy. Suicide vector system as a gentherapeutic antiretroviral strategy against HIV-1: Specific elimination of HIV-1 infected cells by HIV-1 LTR driven suicide genes presents a promising strategy. Clinical applications of this approach, however, depend on a fast and effective suicide gene which is exclusively expressed in HIV-1 infected cells. These preconditions have not yet been fulfilled so far. Thus, the human pro-apoptotic protein truncated Bid which rapidly and efficiently induces apoptosis was tested in the in the context of the novel HIV-1 LTR-based, Tat- and Rev-dependent transgene expression vector pLRed(INS)2R. This combination led to very efficient induction of apoptosis within 24 hours dependent on the presence of both HIV-1 proteins Tat and Rev. Induction of apoptosis was not observed in the absence of Tat and Rev. HIV-1 replication was very efficiently suppressed showing that this suicide vector has the potential for effective use in a gene therapy to exclusively eliminate HIV-1 infected cells.

Abstract

Trotz ständig verbesserter und erweiteter Therapieoptionen ist eine HIV-1 Infektion gegenwärtig immer noch unheilbar. Das Auftreten Medikamenten-resistenter Viren macht eine Behandlung HIV-1 Infizierter zudem schwierig und führt bei einer Vielzahl von HIV-1 Patienten zum Therapieversagen. Neue therapeutische Strategien gegen HIV-1 sind daher zwingend erforderlich. Verschiedene antiretrovirale Strategien zur Bekämpfung von HIV-1 wurden auf ihre potentielle therapeutische Anwendbarkeit hin überprüft. RNA-Interferenz als antiretrovirale Strategie gegen Medikamenten-resistente HIV-1 Varianten: Es wurde die Möglichkeit untersucht, Medikamenten-resistente Viren gezielt durch RNAi zu inhibieren. Spezifisch gegen HIV-1 und die Lamivudin-resistente Variante HIV-1M184V konstruierte siRNAs unterdrückten die Replikation der jeweiligen Virusvariante hoch effektiv. Beide siRNAs diskriminierten sehr spezifisch zwischen HIV-1 und HIV-1M184V und inhibierten somit ausschließlich ihr jeweiliges Ziel-Virus. Eine Kombination verschiedener effektiver siRNAs führte, im Vergleich zu jeder siRNA einzeln, zu keiner stärkeren Hemmung der Virusreplikation. Durch die Kombination von siRNA-M184V mit dem konventionellen antiretroviralen Medikament Lamivudin wurde in Mischinfektionsexperimenten sowohl die Replikation von HIV-1 als auch der Lamivudin-resistenten Variante HIV-1M184V effektiv unterdrückt und somit die potentiell therapeutische Anwendbarkeit dieser antiretroviralen Strategie gezeigt. Protein-Austauschsystem als antiretrovirale Strategie gegen HIV-1: Das proof-of-concept eines regulierbaren Proteinaustauschsystems, das als gentherapeutische Strategie nicht nur bei einer HIV-1 Infektion Anwendung finden kann, wurde am Beispiel des humanen Oberflächen- und HIV-1 Hauptrezeptors CD4 durchgeführt. Mittels einer CD4-spezifischen microRNA wurde die Expression des CD4-Wildtyp Proteins gehemmt. Gleichzeitig wurde eine CD4-Mutante exprimiert, die weder von der anti-CD4 spezifischen miRNA gehemmt noch von HIV-1 als Rezeptor für den Eintritt in die Zelle genutzt werden kann. Durch ein neuartiges Tetrazyklin-abhängiges Regulationssystem war sowohl die Hemmung der CD4-Wildtyp Expression als auch die Induktion der Expression der CD4-Mutante durch die Zugabe unterschiedlicher Tetrazyklinderivate nahezu stufenlos und teilweise unabhängig voneinander regulierbar. Dieser CD4-Austausch kann dazu führen, dass die Vermehrung von HIV-1 in der ersten Phase des Replikationszyklusses gestoppt wird. Suizidvektorsystem als gentherapeutische antiretrovirale Strategie gegen HIV-1: Kein bislang untersuchtes Suizidgensystem entspricht allen Anforderungen, die an diese Strategie gestellt werden muss: Hohe Effizienz, Geschwindigkeit, Spezifität und Sicherheit. Um allen diesen Ansprüchen zu entsprechen, wurde das hoch effektive humane pro-apoptotische Protein tBid als Suizidgen in den neuartigen HIV-1 LTR basierten, Tat- und Rev-abhängigen Expressionsvektor pLRed(INS)2R mit reduzierter Basalaktivität kloniert und dieser Suizidvektor anschließend auf seine Eigenschaften untersucht. Ohne HIV-1 Tat und Rev wurde kein Zelltod induziert. Auch Rev alleine führte nicht zur Induktion der Apoptose. Tat alleine führte zu einer geringen, Tat & Rev hingegen zur einer hoch effektiven Induktion des Zelltodes. Durch Kotransfektionsexperimente wurde gezeigt, dass mit dem proviralen Klon HIV-1 pNL4-3 transfizierte Zellen spezifisch eliminiert werden und so die Produktion infektiöser Viruspartikel unterbunden wurde.

DOI
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