Toleranzmechanismen für anti-DNA Autoantikörper im Keimzentrum

dc.contributor.advisorWinkler, Thomas
dc.contributor.authorSchroeder, Kristin
dc.date.accessioned2013-02-06
dc.date.available2023-10-15T20:08:13Z
dc.date.created2012
dc.date.issued2013-02-06
dc.description.abstractThe production of autoantibodies against nuclear antigens is a hallmark of systemic lupus erythematosus (SLE) and also indicates a loss of B cell tolerance. The 33.C9 IgG anti-dsDNA antibody is derived from a patient with SLE. Three somatic mutations of the 33.C9 antibody are necessary and sufficient for the binding to dopple strand DNA (dsDNA), nucleosomes and histones as the reversion of the somatic mutations to germ line sequence abolished binding to these antigens. The same somatic mutations that generate dsDNA binding also led to the binding of apoptotic cells. In patients with SLE an impaired clearance by macrophages of apoptotic cells causes accumulation in the germinal center of nuclear material from post-apoptotic cells, which may serve as selecting antigen for anti-dsDNA-binding B-cells. Therefore the hypothesis was concluded that autoreactive B-cells are generated from non-autoreactive precursors during the germinal center reactions. The accidentally generated autoreactive B-cells are positively selected by chromatin, decorating the surfaces of follicular dendritic cells (FDCs). This hypothesis was tested in mice, which express the 33.C9 germ line variant antibody as BCR. Therefore, we targeted the B-cell receptor (BZR) heavy- (HC) and light chain (LC) loci to obtain 33.C9 HC (33.C9Hi/+) and 33.C9 LC (33.C9Li/+) mice. After breeding 33.C9 immunglobulin integrated mice (33.C9Igi mice) were obtained. As expected, B cells expressing the revertant BCR develop normally and show no evidence for abnormal tolerization. Using a phage display library we isolated a specific antigen that recognizes the 33.C9Igi B-cells in cytofluorometry. Upon immunization with this surrogate phage antigen the transgenic B cells form germinal centers, undergo somatic hypermutation especially in the complementary determining regions (CDR) and affinity maturation. The three critical somatic mutations, which are necessary and sufficient for the acquisition of high affinity anti-dsDNA binding, were very rarely observed in isolated B cell hybridoma (n>100); In addition, they never occurred in an individual B cell clone. In accordance with this, anti-DNA autoantibodies do not develop, even after repetitive immunizations and when FDCs were MFG-E8 deficient in the germinal center (these mice reportedly show an impaired clearance of follicular apoptotic cells). The exceptions were aged bone marrow chimeric mice (> 10 month) with FDCs carrying the disruption of the MFG-E8 gene. These results strongly suggest a self-tolerance checkpoint by deletion of autoreactive clones during or after the germinal center reaction. In a second project the role of glycocorticoids was analyzed in the MFG-E8-dependent clearance of apoptotic cells by macrophages. Dexamethasone increased the phagocytosis of apoptotic cells in wild type but not in MFG-E8 Knockout mice. The normalization of the MFG-E8 dependent phagocytosis by glycocorticoids is a novel aspect of the anti-inflammatory treatment of patients with SLE.en
dc.description.abstractDie Produktion von Antikörpern gegen nukleäre Autoantigene ist ein Kennzeichen der chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes (SLE) und ein Hinweis für den Verlust der B-Zell Toleranz. Der anti-dsDNA Antikörper 33.C9 ist vom IgG Isotyp und wurde aus einer SLE-Patientin isoliert. Drei somatische Mutationen des Ausgangsantikörpers 33.C9 sind notwendig und ausreichend um eine Reaktivität gegen doppelsträngige DNA (dsDNA), Nukleosomen und Histone zu generieren. Im Gegensatz dazu zeigte der Vorläufer in der Keimbahnkonfiguration keinerlei Reaktivität gegen diese Autoantigene. Dieselben Mutationen, die eine Reaktivität gegen dsDNA erzeugten, führten auch zur Bindung an apoptotische Zellen. Aufgrund eines Phagozytosedefekts der Makrophagen einer Vielzahl von Patienten mit SLE akkumuliert nukleäres Material post-apoptotischer Zellen im Keimzentrum und steht so als selektives nukleäre Antigen für autoreaktive B-Zellen zur Verfügung. Diese Daten führten zu der Hypothese, dass autoreaktive B-Zellen während der Keimzentrumsreaktion aus nicht autoreaktiven Vorläufern entstehen, die an Chromatin positiv selektioniert werden, das von follikulären dendritische Zellen (FDCs) präsentiert wird. Diese Hypothese sollte in Mäusen getestet werden, die die Keimbahnvariante des dsDNA reaktiven Antikörpers 33.C9 als B-Zell Rezeptor (BZR) tragen. Die Mäuse werden in dieser Arbeit als 33.C9 Immunglobulin integrated (Igi) Mäuse bezeichnet. Dazu sollte durch homologe Rekombination die variable Region der Schwerkette (HC) der Keimbahnversion des 33.C9 Antikörpers in den Immunglobulin-Lokus der HC (IgH) (33.C9Hi/+ Mäuse) und die der Leichtkette (LC) in den Kappa Immunglobulin (Igκ)-Lokus (33.C9Li/+ Mäuse) integriert werden. Wie erwartet, entwickeln sich B-Zellen mit revertiertem Rezeptor normal und zeigen keinerlei Anzeichen von Deletion durch Toleranz-induzierende Mechanismen. Es wurde kein Hinweis für Rezeptor-Editing und ein geringes Maß an VH-Replacement in 33.C9Igi Mäusen beobachtet. Mit Hilfe einer phage display library wurde ein spezifisches Antigen für B-Zellen isoliert, das den 33.C9Igi Rezeptor trägt. Nach Immunisierung mit dem spezifischen Phagen bildeten 33.C9Igi B-Zellen Keimzentren aus, in denen sie besonders in den complementary determining regions (CDRs) somatisch hypermutierten und Affinitätsreifung durchliefen. Die drei kritischen somatischen Mutationen, welche notwendig und ausreichend für eine hochaffine Bindung an dsDNA sind, wurden in einer großen Kollektion von Sequenzen (n>100) nur sehr selten beobachtet und niemals alle drei kritischen Mutationen in einem Klon. In Übereinstimmung damit entwickelten 33.C9Igi Mäuse, auch nach repetitiver Immunisierung, keine anti-dsDNA Autoantikörper. Lediglich in alten, knochenmarks-chimären Mäusen (>10 Monate) mit MFG-E8 defizienten FDCs konnten vereinzelt signifikante anti-dsDNA Antikörper beobachtet werden. Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass ein Selbsttoleranz-Kontrollpunkt im Keimzentrum existieren muss, der autoreaktive Klone während oder nach der Keimzentrumsreaktion deletiert. In einem zweiten Teil der Arbeit sollte die Rolle von Kortikoiden bei der MFG-E8 abhängigen Clearance apoptotischer Zellen durch Makrophagen adressiert werden. Dexamethason steigerte die Phagozytose apoptotischer Zellen im Wildtyp- nicht jedoch im MFG-E8 Knockout Hintergrund. Die Normalisierung der MFG-E8-abhängigen Phagozytose apoptotischer Zellen durch Glucocorticoide stellt einen neuen Aspekt der anti-inflammatorischen Behandlung von Patienten mit SLE dar.de
dc.identifier.opus-id2914
dc.identifier.urihttps://open.fau.de/handle/openfau/2914
dc.identifier.urnurn:nbn:de:bvb:29-opus-40475
dc.language.isode
dc.subjectanti-DNA antibodies
dc.subjectSLE
dc.subjectgerminal center
dc.subjectsomatic mutation
dc.subject.ddcDDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 50 Naturwissenschaften :: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.titleEvolution of anti-DNA autoantibodies by somatic hypermutation: Evidence for post-mutational B-cell toleranceen
dc.titleToleranzmechanismen für anti-DNA Autoantikörper im Keimzentrumde
dc.typedoctoralthesis
dcterms.publisherFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
local.date.accepted2012-12-07
local.sendToDnbfree*
local.subject.fakultaetNaturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
local.subject.gndAnti-DNS-Antikörper
local.subject.gndSystemischer Erythematodes
local.subject.gndSomatische Mutation
local.subject.gndKeimzentrum
local.thesis.grantorFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) Naturwissenschaftliche Fakultät
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