Genexpression von DNMT-1, -3a und -3b, MBD2, CREB, HERP und Alpha-Synuclein während des frühen Alkoholentzugs

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2017-12-04
Issue Year
2017
Authors
Haiberger, Ilka
Editor
Abstract
  1. Abstract 2.1 Background and intentions Although alcohol dependence represents a widespread problem, the pathomechanism of this disease is to a large extent not yet investigated. In the recent past, a few studies have shown relationships between several genes specific to addictions, genes influencing the methylation and the use of alcohol. The present study focuses on the expression of several genes during the early alcohol withdrawal. DNA methyltransferases (DNMT-1, DNMT-3a and DNMT-3b), MBD2 (methyl-CpG binding domain protein 2), CREB (cAMP response element-binding protein), HERP (homocysteine-induced endoplasmic reticulum stress protein) and alpha-synuclein were investigated. 2.2 Patients and methods Thirty male patients were included into the study immediately after admission for residential alcohol withdrawal. Venous blood was taken in EDTA monovettes at day of admission, at day 1, day 3 and day 7 of the withdrawal, which was quick-frozen at -80 °C. RNA was isolated using a modified Quiagen protocol and was converted into complementary cDNA via reverse transcription, which was the basis for the quantitative polymerase chain reaction. PCR-based fluorescence measurements were used to quantify the amount of cDNA. SYBR Green 1 was used, a fluorescent dyestuff, which binds to double-stranded DNA, irrespective of the sequence. As an internal standard we used beta-actin. 2.3 Results Within the present study, the mRNA-levels of DNMT-1 showed, during the early alcohol withdrawal, nearly constant levels. In DNMT-3a, an increase of the mRNA-levels was registered. The mRNA-levels of DNMT-3b showed a small increase during the early withdrawal. Intially, the mRNA-level of MBD2 decreased slightly, then showed a moderate increase, then decreased again. The mRNA-levels of CREB increased with a maximum at day 3. The mRNA-levels of HERP and alpha-synuclein showed an increase in the beginning of our study. Later, the mRNA-levels of both proteins persisted on a higher level. The increase of HERP was higher than in the case of alpha-synuclein. Among those findings, only the change of the HERP-mRNA reached significance in the statistiscal analyses. 2.4 Conclusions The goal of the present study was to explore the expressions of DNMT-1, DNMT-3a, DNMT-3b, MBD2, CREB, HERP and alpha-synuclein during the early alcohol withdrawal. In order to develop new therapeutic approaches further studies could follow this direction of research. Moreover, we hypothesize that DNMT-3a or HERP might prove useful as a biomarker for the course of alcoholic diseases.
Abstract
  1. Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Obwohl Alkoholabhängigkeit ein weit verbreitetes Problem darstellt, sind die molekularen Pathomechanismen dieser Erkrankung noch weitgehend ungeklärt. In jüngster Vergangenheit konnten in einigen Studien Zusammenhänge zwischen verschiedenen suchtspezifischen Genen, Genen, welche die Methylierung beeinflussen, und Alkoholkonsum beobachtet werden. Im Rahmen der hier vorliegenden Studie wurden die Expressionslevel mehrerer dieser Gene während des frühen Alkoholentzugs untersucht. Dabei handelt es sich um DNA-Methyltransferasen (DNMT-1, DNMT-3a und DNMT-3b), MBD2 (Methyl-CpG binding domain protein 2), CREB (cAMP response element binding protein), HERP (Homocysteine-induced endoplasmic reticulum stress protein) und Alpha-Synuclein. 1.2 Patienten und Methoden In die Studie wurden 30 männliche Patienten sofort nach stationärer Aufnahme zum Alkoholentzug eingeschlossen. Am Aufnahmetag auf Station, an Tag 1, Tag 3 und Tag 7 des Entzugs wurde jeweils venöses Blut in EDTA-Monovetten abgenommen, das bei -80 °C schockgefroren wurde. Mittels eines modifizierten Quiagen-Protokolls wurde RNA isoliert. Diese wurde durch reverse Transkription in eine komplementäre cDNA umgeschrieben, die wiederum die Grundlage für die quantitative Polymeraseketten-reaktion darstellte. Mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen während der PCR-Zyklen wurde die relative DNA-Menge quantifiziert. Dabei wurde SYBR Green I verwendet, ein doppelstrang-spezifischer, sequenzunabhängiger Fluoreszenzfarbstoff. Als interner Standard lief bei allen Schritten Beta-Aktin mit. 1.3 Ergebnisse Während des frühen Alkoholentzugs zeigten sich in der vorliegenden Studie bei DNMT-1 nahezu gleichbleibende mRNA-Level. Bei DNMT-3a wurde ein Anstieg der mRNA-Level verzeichnet. Die mRNA-Level von DNMT-3b zeigten während des Beobachtungszeitraumes einen geringen Anstieg. Bei MBD2 fiel der mRNA-Level zunächst ab, stieg im Verlauf an und fiel dann wieder ab. Bei CREB wurde ein Anstieg des mRNA-Level mit Maximum am 3. Tag verzeichet. Die mRNA-Level von HERP und Alpha-Synuclein zeigten jeweils zu Beginn der Studie einen Anstieg, im weiteren Verlauf persistierten die mRNA-Level beider Proteine auf erhöhtem Niveau. Der Anstieg bei HERP war größer als der bei Alpha-Synuclein. Unter diesen Beobachtungen war die Veränderung der mRNA-Level bei HERP die einzige, die statistische Signifikanz erreichte. 1.4 Schlussfolgerungen In dieser Studie wurden explorativ die Expressionen von DNMT-1, DNMT-3a, DNMT-3b, MBD2, CREB, HERP und Alpha-Synuclein bei Patienten im frühen Alkoholentzug untersucht. Die Ergebnisse könnten als Grundlage zur Entwicklung neuer Therapieansätze dienen. Vorstellbar wäre auch die Verwendung von DNMT-3a oder HERP als Biomarker für den Verlauf des Alkoholentzugs.
DOI
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