Untersuchung der neuroglialen Stammzellfaktoren Sox8 und Sox10 im Rahmen der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis als Modell für die Multiple Sklerose

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2019-10-28
Issue Year
2019
Authors
Knoblach, Nadine
Editor
Abstract

Background A genome-wide association study identified Sox8 as a risk gene for multiple sclerosis. This stem cell factor Sox8 is ubiquitary expressed in embryonic and adult stages and particularly influences formation and differentiation of the neural crest but also glial development in the CNS. Nevertheless, the pathogenetic relation to multiple sclerosis is still unclear. An EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) model with Sox8-/- mice was performed to address this question. The closely related Sox10 protein recently showed immunological relevance as the thymus of heterozygous Sox10-/+ mice revealed a higher proportion of an anti-inflammatory subpopulation of T cells (Tregs). Transgenic Sox10fl/flxCD4Cre mice were generated to analyse a potential role of Sox10 in T cells within the scope of EAE.

Methods Two different MOG35-55 EAE experiments were performed: Firstly, homozygous Sox8-/- mice were compared to their normal littermates (Sox8+/+); on the other hand, Sox10fl/flxCD4Cre mice were examined in comparison with the control group Sox10fl/fl. In each of the experiments, animals were sacrificed at defined time points and spinal cord tissue was processed for histological studies. EAE induced tissue changes in the spinal cord were then further analysed by different stainings: inflammatory infiltrates by T cells (CD3+) and macrophages (Mac3+); degree of tissue damage concerning demyelination (LFB / CNPase staining) and axonal densitiy (Bielschowsky staining); quantity of oligodendrocytes (Olig2+ / NogoA+) and GFAP+ astrocytes. An additional double immunofluorescence staining with Claudin3 and GFAP was done for the Sox8 experiment.

Results Sox8-/- mice displayed a more severe EAE course with progredient disability which correlated with the diagnosed damage: Sox8-/- mice suffered from more inflammation and demyelination; besides they showed a significant loss of axons and oligodendrocytes whereas astrocytes were significantly increased according to reactive gliosis. Staining with Claudin3 gave no hint for disintegrity of the blood brain barrier comparing Sox8-/- with Sox8+/+ controls. Another coincidental finding was staining of Claudin3 expressing astrocyte foot processes (Claudin3+ GFAP+) in close relation to blood vessels. Sox10fl/flxCD4Cre mice on the other hand showed no differences in symptom severity during EAE in comparison to Sox10fl/fl controls. Surprisingly the histological analyses conflicted with these findings as there were significant differences concerning oligodendrocytes and axonal density. Nevertheless, this was presumably only a cellular and/or statistical effect with no clinical relevance.

Conclusions The experiments were successful to confirm the MS susceptibility of Sox8 in case of EAE. Histological findings displayed inflammatory as well as degenerative aspects, the latter possibly explained by failure of recruitment of oligodendrocytes in the course of repair mechanisms. An impairment of myelination in mature oligodendrocytes mediated by Sox8 can’t be ruled out as well. The increase of inflammation could not be attributed to disruption of blood brain barrier in regard to equal Claudin3 staining. The mouse model was consequently able to detect specific tissue changes whereas the exact pathogenetic mechanism between Sox8 and multiple sclerosis is still unclear. An immunological role for Sox10 in T cells could not be proved in our EAE model; however, such a function cannot be excluded for Sox10, for example in other cell types than T cells.

Abstract

Hintergrund & Ziele In einer genomweiten Assoziationsstudie wurde Sox8 als Suszeptibilitätsgen für Multiple Sklerose identifiziert. Der neurogliale Stammzellfaktor Sox8 ist an diversen entwick-lungs¬bedingten Prozessen beteiligt, vor allem in der Neuralleiste und ZNS-Gliogenese, jedoch fehlt bisher der patho¬genetische Zusammenhang mit der MS. Dies soll anhand eines Mausmodells der Multiplen Sklerose, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalo¬myelitis (EAE), mit Sox8-/--Mäusen untersucht werden. Für den Transkriptionsfaktor Sox10 – ein mit Sox8 verwandtes Protein – wurden kürzlich immunmodulatorische Funktionen entdeckt, wobei eine anti-inflammatorische Sub¬population von T-Zellen (sog. T-regulatorische Zellen) bei Sox10-heterozygoten Mäusen im Thymus vermehrt war. Ein möglicher Effekt von Sox10 in T-Zellen soll deswegen im Rahmen der EAE mit trans¬genen Sox10fl/flxCD4Cre-Mäusen nachgewiesen werden.

Methoden Es wurden zwei große Versuchsreihen in Form der MOG35-55-EAE durchgeführt: Zum einen wurden Sox8-/--Mäuse mit normalen Sox8+/+-Wurfgeschwistern als Kontrollen im EAE-Versuch verglichen; zum anderen fand der Vergleich von Sox10fl/flxCD4Cre- mit Sox10fl/fl-Mäusen (= Kontrollgruppe) statt. Bei beiden Versuchsreihen wurden die Tiere zu definierten Zeitpunkten analysiert und das Rückenmarksgewebe für histologische Untersuchungen aufbe¬reitet. Die im Rahmen der EAE abgelaufenen Gewebeverände-rungen im Rückenmark wurden dann mittels verschiedener Färbungen näher charak-terisiert: Größe der Entzündungsinfiltrate bezüglich T-Zellen (CD3+) und Makrophagen (Mac3+); Ausmaß des Gewebeschadens in Form von Demyelinisierung (LFB- / CNPase-Fär¬bung) und Axondichte (Bielschowsky-Färbung); Veränderungen der Anzahl von Oligodendro¬zyten (Olig2+ / NogoA+) und GFAP+-Astrozyten. Für den Sox8-Versuch wurde außerdem eine Doppelimmunfluoreszenz-Färbung mit Claudin3 und GFAP angefertigt.

Ergebnisse & Beobachtungen Die Sox8-/--Gruppe zeigte einen deutlich kränkeren EAE-Verlauf mit progredientem klini-schem Defizit, was mit den anschließend durchgeführten histologischen Analysen korre-lierte: Sox8-/--Mäuse wiesen deutlich größere Entzündungsinfiltrate und mehr Demyelinisierung auf; die Axondichte war signifikant verringert sowie auch die Anzahl der Oligodendrozyten; Astrozyten waren im Sinne einer reaktiven Gliose vermehrt. Eine Untersuchung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke mittels Anfärbung von Claudin3 ergab keine offensichtlichen Unterschiede zwischen Sox8-/- und Sox8+/+. Ein Zufallsbefund war die Anfärbung von Claudin3-exprimierenden Astrozyten-Fortsätzen (Claudin3+ GFAP+) in der Nähe von Blutgefäßen. Der Vergleich von Sox10fl/flxCD4Cre-Mäusen mit Sox10fl/fl-Kontrolltieren ergab bezüglich des EAE-Verlaufs keine klinischen Unterschiede. Die histologischen Analysen ergaben vor allem hinsichtlich der Oligodendrozyten und der Axondichte widersprüchliche Signifikanzen, doch sind diese vermutlich nur auf zellulärer Ebene vorhanden und eventuell auch ein rein statistischer Effekt. Eine klinische Relevanz ergibt sich jedoch nicht aus diesen Ergebnissen.

Schlussfolgerungen Die Suszeptibilität von Sox8 für Multiple Sklerose wurde im EAE-Modell bestätigt, wobei die histologischen Analysen eine neuroinflammatorische und neurodegenerative Kom-po¬nente ergaben. Letztere lässt sich beispielsweise im Sinne einer Sox8-vermittelten Rekrutierungs¬störung von Oligodendrozyten erklären, die für Reparaturmechanismen notwendig ist. Auch eine Sox8-vermittelte Störung der Myelinisierung durch reife Oligodendrozyten ist nicht auszuschließen. Der neuroinflammatorische Aspekt war unerwartet und konnte durch eine bezüglich Claudin3 intakte Blut-Hirn-Schranke nicht plausibel erklärt werden. Im Maus-Modell ließen sich also spezifische Gewebseffekte nachweisen, ein genauer patho¬genetischer Zusammenhang zwischen Sox8 und Multipler Sklerose steht jedoch noch aus. Für Sox10 hingegen konnte kein immunmodulatorischer Effekt in T-Zellen im Rahmen des EAE-Modells bestätigt werden. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass Sox10 solche Funktionen beispielsweise in anderen Zellen ausübt.

DOI
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